Ensayo de fagocitosis de células vivas de células similares a la microglía utilizando sinaptosomas humanos
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociencia
0 vistas • 3:28 min • April 28th, 2025
Tome una placa de pocillos múltiples que contenga células similares a la microglía que exhiban actividad fagocítica.
Incubar con una tinción nuclear para etiquetar los núcleos.
Agregue un inhibidor de polimerización de actina al pocillo de control negativo.
Durante la incubación, el inhibidor se une a los filamentos de actina, inhibiendo la polimerización de la actina y la fagocitosis.
Mantenga la placa a bajas temperaturas y agregue sinaptosomas humanos marcados con colorante sensible al pH: fragmentos aislados de terminales sinápticos neuronales.
Centrifugar la placa a bajas temperaturas para promover las interacciones célula-sinaptosoma, pero evitar la absorción prematura.
Transfiera la placa a un sistema de imágenes de células vivas.
En el pozo de prueba, los sinaptosomas se fagocitan y se fusionan con los lisosomas formando fagolisosomas. El ambiente ácido lisosomal activa el colorante, lo que da como resultado su fluorescencia.
Con el tiempo, en el pozo de prueba, se engullen más sinaptosomas causando un mayor aumento de la fluorescencia.
Sin embargo, en el pozo de control negativo, se inhibe la polimerización de la actina, lo que impide la captación de sinaptosomas. La mínima fluorescencia resultante confirma la dependencia de la fluorescencia de la fagocitosis mediada por actina.
El día del ensayo, retire 40 microlitros de medio por pocillo y agregue 10 microlitros de la solución de tinción nuclear. Incuba el plato durante dos horas. Descongele los sinaptosomas marcados en hielo y sonique suavemente con un sonicador de agua durante un minuto. Nuevamente, coloque inmediatamente los sinaptosomas en hielo. Diluya los sinaptosomas marcados y el medio completo IMG a 1 microlitro de sinaptosomas por 50 microlitros de medio.
Para el control negativo, prepare 60 citocalasina D micromolar en medio completo IMG para inhibir la polimerización de la actina y, por lo tanto, la fagocitosis. Luego, agregue 10 microlitros de esta solución a cada pocillo para obtener una concentración final de 10 micromolares e incube durante 30 minutos. Retire la placa de la incubadora e incube a 10 grados centígrados durante 10 minutos. Mantener el plato en hielo y añadir 50 microlitros de medio que contenga sinaptosomas.
Centrifugar la placa a 270 veces g durante tres minutos a 10 grados Celsius y mantener la placa en hielo hasta la adquisición de imágenes. Inserte la placa en un lector de imágenes de células vivas y seleccione los pocillos que se analizarán. Luego, seleccione una lente de objetivo de 20x. A continuación, ajuste el tiempo de integración de la intensidad del LED o del diodo emisor de luz de enfoque y la ganancia del campo brillante y los canales azules. La fluorescencia de los sinaptosomas debe ser insignificante en el punto de tiempo inicial.
Seleccione el número de mosaicos individuales que se adquirirán en un montaje por pozo. Adquiera 16 mosaicos en el centro del pozo, obteniendo imágenes de aproximadamente el 5% del área total del pozo. Ajuste la temperatura a 37 grados Celsius y el intervalo de tiempo deseado para la obtención de imágenes.
Descripción general
Este estudio investiga la actividad fagocítica de células similares a microglía mediante un sistema de imagenología en células vivas. Se analizan los efectos de la inhibición de la polimerización de actina sobre la captación de sinaptosomas para comprender los mecanismos de la fagocitosis.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Inmunología
Antecedentes
- Las microglías son células inmunitarias del cerebro que desempeñan un papel crucial en el mantenimiento de la homeostasis.
- La fagocitosis es una función clave de las microglías, que les permite eliminar restos celulares y componentes sinápticos.
- La polimerización de actina es esencial para el proceso fagocítico en muchos tipos celulares.
- Comprender los mecanismos de la fagocitosis puede proporcionar información sobre las afecciones neuroinflamatorias.
Objetivo del estudio
- Evaluar el papel de la polimerización de actina en la fagocitosis de sinaptosomas por células similares a microglía.
- Utilizar imágenes de células vivas para visualizar la dinámica de la captación de sinaptosomas.
- Establecer una condición de control que inhiba la polimerización de actina para su comparación.
Métodos Utilizados
- Las células similares a microglía se cultivaron en placas de múltiples pocillos y se trataron con colorantes nucleares.
- Se añadió un inhibidor de la polimerización de actina a los pocillos del control negativo.
- Los sinaptosomas se marcaron con un colorante sensible al pH y se incubaron con las células.
- Se realizó imágenes en células vivas para monitorear los cambios de fluorescencia indicativos de fagocitosis.
Resultados Principales
- En los pozos de prueba, el aumento de la fluorescencia indicó la fagocitosis exitosa de sinaptosomas.
- Los pozos de control negativo mostraron fluorescencia mínima debido a la inhibición de la polimerización de actina.
- La intensidad de la fluorescencia se correlacionó con el número de sinaptosomas ingeridos a lo largo del tiempo.
- Los resultados confirmaron la dependencia de la fagocitosis respecto a la dinámica de la actina.
Conclusiones
- La polimerización de actina es fundamental para la actividad fagocítica de células similares a microglías.
- La imagenología en tiempo real es un método eficaz para estudiar las interacciones y la dinámica celular.
- Este estudio mejora la comprensión de la función de las microglías en el mantenimiento sináptico y la neuroinflamación.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los ensayos cuantitativos de fagocitosis en células vivas que utilizan sinaptosomas humanos y células similares a microglía proporcionan una plataforma robusta para investigar mecanismos neuroinmunes relevantes para las vías de enfermedades neurodegenerativas. Este enfoque permite la reducción mecanicista de riesgos y la validación de objetivos mediante el aislamiento de la función fagocítica dependiente de actina en un sistema relevante para el ser humano. El ensayo brinda confianza predictiva para decisiones tempranas en carteras de investigación sobre neuroinflamación y mantenimiento sináptico.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la validación funcional de las vías de fagocitosis de las microglías utilizando sustratos derivados de humanos.
- Apoya la reducción mecanicista de riesgos al aislar la polimerización de actina como una variable crítica en la eliminación sináptica.
- Facilita la investigación basada en hipótesis de dianas neuroinmunitarias implicadas en la progresión de enfermedades.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona una lectura reproducible y cuantitativa de la actividad fagocítica mediante fluorescencia sensible al pH.
- Normaliza controles negativos utilizando inhibidores de la polimerización de actina para garantizar la especificidad del ensayo.
- Prepara sistemas celulares validados similares a microglía para estudios posteriores de cribado de compuestos o perturbaciones genéticas.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Alinea métricas de fagocitosis in vitro con mecanismos de eliminación sináptica relevantes para la enfermedad.
- Permite la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica en modelos de neuroinflamación y neurodegeneración.
- Apoya el avance ajustado al riesgo de dianas neuroinmunitarias basado en evidencia funcional.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este ensayo en células vivas se sitúa dentro del continuo de descubrimiento temprano hasta la identificación del candidato principal, proporcionando datos accionables para la validación de dianas y estudios mecanicistas en neurobiología.
- Biología del Descubrimiento: Cuantifica la fagocitosis dependiente de actina, aclarando la participación de vías en la eliminación sináptica.
- Selección: Proporciona resultados estandarizados y reproducibles basados en fluorescencia para análisis comparativo.
- Análisis: Permite la medición resuelta en el tiempo de la captación de sinaptosomas y la comparación estadística entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos in vitro con modelos preclínicos de neuroinflamación al alinearse con mecanismos de la enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de ensayo reutilizable para diversos programas de dianas neuroinmunes.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de dianas neuroinmunitarias y en la reducción de riesgos mecanicistas.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización de ensayos entre los equipos de descubrimiento.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de continuar o descartar proyectos al proporcionar datos funcionales cuantitativos y relevantes para el ser humano.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de programas de neuroinflamación y mantenimiento sináptico.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en imágenes de células vivas y análisis cuantitativo de fluorescencia.
- Necesita acceso a preparaciones de sinaptosomas humanos y cultivos validados de células similares a microglía.
- Exige controles negativos estandarizados para la especificidad y reproducibilidad del ensayo.
- Puede requerir adaptación para diferentes fuentes celulares o sustratos sinápticos.
- Depende de infraestructura de imagenología y tuberías robustas de análisis de datos.
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Última actualización: 29 agosto 2026