Detección del cotransportador neuronal de cloruro de potasio fosforilado 2 mediante Western Blotting

Tome un lisado celular que contenga cotransportador de cloruro de potasio 2, o proteínas KCC2, que regulan los niveles de cloruro neuronal.

La fosforilación en los sitios reguladores interrumpe la función de KCC2, modulando la actividad neuronal.

Agregue el lisado a las perlas conjugadas con anticuerpos dirigidos a KCC2 fosforilado. Incube para permitir la unión, luego lave para eliminar las proteínas no unidas y los desechos celulares.

Tratar con un tampón desnaturalizante a alta temperatura para liberar KCC2, luego centrifugar para separar las perlas.

Cargue el sobrenadante que contiene KCC2 en un gel de electroforesis. Separe las proteínas en bandas para confirmar la presencia de KCC2 fosforilado.

Transfiera las bandas a una membrana, luego incube en una solución de bloqueo para enmascarar los sitios de unión no específicos.

Incubar con anticuerpos primarios dirigidos a KCC2 fosforilado.

Lavar, luego incubar con anticuerpos secundarios marcados con enzimas para marcar los anticuerpos primarios.

Lava de nuevo, luego agrega un sustrato quimioluminiscente, que reacciona con la enzima para producir luz.

Mida la intensidad de la luz para cuantificar el KCC2 fosforilado en el lisado.

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