Detección del cotransportador neuronal de cloruro de potasio fosforilado 2 mediante Western Blotting

Tome un lisado celular que contenga cotransportador de cloruro de potasio 2, o proteínas KCC2, que regulan los niveles de cloruro neuronal.

La fosforilación en los sitios reguladores interrumpe la función de KCC2, modulando la actividad neuronal.

Agregue el lisado a las perlas conjugadas con anticuerpos dirigidos a KCC2 fosforilado. Incube para permitir la unión, luego lave para eliminar las proteínas no unidas y los desechos celulares.

Tratar con un tampón desnaturalizante a alta temperatura para liberar KCC2, luego centrifugar para separar las perlas.

Cargue el sobrenadante que contiene KCC2 en un gel de electroforesis. Separe las proteínas en bandas para confirmar la presencia de KCC2 fosforilado.

Transfiera las bandas a una membrana, luego incube en una solución de bloqueo para enmascarar los sitios de unión no específicos.

Incubar con anticuerpos primarios dirigidos a KCC2 fosforilado.

Lavar, luego incubar con anticuerpos secundarios marcados con enzimas para marcar los anticuerpos primarios.

Lava de nuevo, luego agrega un sustrato quimioluminiscente, que reacciona con la enzima para producir luz.

Mida la intensidad de la luz para cuantificar el KCC2 fosforilado en el lisado.

Pipetear 300 microlitros de proteína G sepharose en un tubo de microcentrífuga. A continuación, centrifugar la solución a 500 G durante dos minutos. Después de desechar el sobrenadante, agregue 500 microlitros de PBS y vórtice bien. Deseche el sobrenadante después de la centrifugación y repita este paso.

A continuación, mezcle 1 miligramo de anticuerpos anti-KCC2 treonina 906 y anti-KCC2 treonina 1007 con 200 microlitros de perlas de proteína G sepharose, antes de completar el volumen a 500 microlitros con PBS. Después de agitar en una plataforma vibratoria o girar la rueda durante dos horas a 4 grados centígrados, repita dos lavados con PBS.

Realice la cuantificación de proteínas en los lisados celulares y agregue 1 miligramo del lisado celular a las perlas lavadas e incube en un rotador de extremo a extremo antes de girar hacia abajo. Realice tres lavados con PBS que contenga 150 milimolares de cloruro de sodio, seguidos de tres lavados con 200 microlitros de PBS antes de volver a suspender el sedimento final en 100 microlitros de tampón de muestra LDS.

Agite los tubos en un agitador de rotor a temperatura ambiente durante cinco minutos. Incubarlos en un bloque calefactor y centrifugarlos antes de usar el sobrenadante para la carga de gel. Ensamble el aparato de fundición Western Blot y vierta gel separador al 8% recién preparado para fundir el gel, dejando aproximadamente 2 centímetros de espacio desde la parte superior del vidrio de fundición. Agregue 200 microlitros de isopropanol absoluto a la configuración y déjelo reposar a temperatura ambiente durante 60 minutos.

Retire el isopropanol con una pipeta y enjuague cuidadosamente el gel con unos 200 microlitros de agua destilada. Después de agregar gel apilable al 6% recién preparado a la configuración de fundición, coloque suavemente el peine y deje reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego, fije el gel fundido en el tanque de electroforesis.

Después de verter el tampón en funcionamiento en el tanque, cargue 5 microlitros de marcador de peso molecular en el primer pocillo y una cantidad igual de proteína en cada pocillo del gel SDS-PAGE. Llene los pocillos vacíos con LDS y deje correr el gel durante unos 90 a 120 minutos a 120 voltios. Rehidratar la membrana de nitrocelulosa con tampón de transferencia que contenga un 20% de metanol.

Enjuague el gel y la membrana con el tampón de transferencia y extiéndalos suavemente sobre la pila de preparación. Organice el sándwich que se transferirá en este orden, electrodo negativo, espuma sándwich, papel de filtro, gel SDS-PAGE enjuagado, membrana de nitrocelulosa enjuagada, papel de filtro, espuma sándwich, electrodo positivo. Una vez hecho esto, apile el sándwich ensamblado en el tanque de transferencia y haga funcionar a 90 voltios durante 90 minutos o 30 voltios durante 360 minutos.

Bloquee la membrana seca durante 1 hora a temperatura ambiente con un tampón de bloqueo. Incube las membranas con diluciones apropiadas de anticuerpo primario y beta actina en tampón de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4 grados centígrados. Luego, dé tres lavados de TBST durante 5 minutos cada uno.

Incube la membrana lavada con un anticuerpo secundario diluido en un tampón de bloqueo durante 60 minutos y repita tres lavados de TBST. Una vez hecho esto, coloque la membrana lavada en la placa de imágenes. Para desarrollar las señales, extienda la solución preparada mezclando volúmenes iguales de cada reactivo de quimioluminiscencia mejorada en la membrana, antes de transferir la placa de imágenes al sistema de imágenes para obtener imágenes.