Evaluación de los niveles de neurotransmisores excitatorios en ratas inducidas por epilepsia crónica

Tome una rata de control y una rata inducida por epilepsia crónica implantadas con una cánula guía y un electroelectrocardiograma, o EEG, en el hipocampo.

La inducción de la epilepsia aumenta la liberación de neurotransmisores excitadores, lo que provoca la afluencia de iones en las células postsinápticas, lo que genera potenciales excitatorios continuos. Esto conduce a ráfagas sincronizadas de actividad eléctrica, denominadas convulsiones, registradas con el electrodo.

Inserte una sonda de microdiálisis con una membrana semipermeable en la cánula.

Ate la rata a la jaula de un sistema de registro de EEG.

Infundir un tampón fisiológico en el tejido cerebral a través de la entrada de la sonda.

Asegurar la ausencia de convulsiones y recolectar líquido extracelular a través de la salida de la sonda para evaluar los niveles de neurotransmisores.

Un nivel basal elevado en la rata epiléptica indica un aumento mediado por la epilepsia.

Infundir un tampón con alto contenido de potasio y recoger muestras.

El aumento de potasio prolonga la excitabilidad neuronal, desencadenando la liberación continua de neurotransmisores.

Un aumento temporal en los niveles de neurotransmisores tanto en las ratas epilépticas como en las de control indica un alto aumento inducido por el potasio.

Comience preparando las sondas de microdiálisis para el primer uso de acuerdo con la guía del usuario del fabricante y llénelas con solución de ringer. Luego, corte trozos de tubería de FEP de 10 centímetros de largo y conéctelos a las cánulas de entrada y salida de la sonda, utilizando los adaptadores de tubería de diferentes colores. Asegúrese de que el tubo toque los adaptadores sin espacio muerto en todas las conexiones.

Retire la cánula falsa de su guía con las pinzas sujetando firmemente la cabeza del animal. Inserte la sonda de microdiálisis en la cánula guía y use plastilina para reafirmar aún más la cánula. A continuación, conecte el animal al sistema de registro de EEG atado. Luego coloque al animal en el cilindro de plexiglás y déjelo explorar el nuevo entorno. Sigue los movimientos de las ratas despiertos y que se mueven libremente.

Luego, conecte la entrada de la sonda a la jeringa de 2.5 mililitros con una aguja de calibre 22 roma que contenga solución de timbre usando los adaptadores de tubos. Introduzca un mililitro de solución de ringer en la sonda en 10 segundos empujando el pistón de la jeringa de 2,5 mililitros continuamente. Verifique si aparece la gota del líquido en la salida para indicar cuándo la sonda está lista para usar. Finalmente, llene las jeringas de 2.5 mililitros conectadas a tubos FEP mediante adaptadores de tubos con solución de timbre y móntelas en la bomba de infusión. Encienda la bomba a dos microlitros por minuto y déjela funcionar durante la noche.

Después de verificar a través de grabaciones de EEG por video, la ausencia de convulsiones en las tres horas anteriores a la recolección de muestras, detenga la bomba que transporta el tubo FEP con jeringas canuladas llenas de solución de ringer. Monte otro juego de jeringas de 2,5 mililitros conectadas a un tubo de FEP con adaptadores de tubo llenos de una solución de timbre modificada que contiene una solución de potasio de 100 milimolares. Encienda la bomba a 2 microlitros por minuto y déjela funcionar. Compruebe la ausencia de burbujas de aire en el sistema y asegúrese de que el tubo toque los adaptadores sin espacio muerto en todas las conexiones.

Luego, verifique la gota del líquido que aparece en la salida para indicar cuándo la sonda está lista para usar. A continuación, conecte el tubo FEP de las jeringas llenas de solución de timbre a la cánula de entrada de la sonda en cada animal y espere la aparición de la gota de líquido en la punta de la salida. Conecte la salida de la sonda al tubo de FEP, lo que conduce a la recolección en el tubo de ensayo.

Inserte el tubo de FEP en el tubo de ensayo cerrado de 0,2 mililitros con una tapa perforada. Y asegúrese de que el tubo permanezca en su lugar fijándolo con un trozo de plastilina. Después de hacer funcionar la bomba a 2 microlitros por minuto durante 60 minutos sin recolectar muestras para equilibrar, el sistema recolecta cinco muestras consecutivas de dializado de 30 minutos en condiciones de referencia. Y almacene muestras en hielo.

Después de 10 minutos, cambie el tubo de las jeringas que contienen solución de timbre de potasio de 100 milimolares a solución de timbre normal y deje funcionar la bomba. Después de la recolección del quinto dializado posterior al equilibrio, recolecte 20 fracciones de dializado de microlitros cada 10 minutos durante una hora. Luego recolecte tres muestras adicionales de dializado de 30 minutos y detenga la bomba. Por último, almacene las muestras a menos 80 grados Celsius después del experimento hasta el análisis de HPLC.