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Neurociencia
0 vistas • 2:34 min • April 28th, 2025
Tome un portaobjetos con cámara con un cultivo monocapa de células endoteliales microvasculares de cerebro de rata, o RBMEC.
Las células están conectadas por proteínas de unión estrecha unidas al citoesqueleto de actina, imitando la capa endotelial de la barrera hematoencefálica.
Sustituya el medio por un medio desoxigenado sin glucosa y, a continuación, coloque el portaobjetos en una cámara de hipoxia.
La falta de disponibilidad de oxígeno y glucosa inhibe la síntesis de ATP. El ATP restante se descompone en derivados de nucleótidos.
El agotamiento de ATP dificulta las bombas de calcio, elevando el calcio intracelular que activa las enzimas oxidorreductasas.
A continuación, reponga con un medio oxigenado y, a continuación, coloque el portaobjetos en una incubadora oxigenada. Las oxidorreductasas activadas utilizan el oxígeno reintroducido para degradar los derivados de nucleótidos, generando especies reactivas de oxígeno o ROS.
ROS interrumpe las interacciones entre las proteínas de unión estrecha e induce vías de señalización que remodelan el citoesqueleto de actina en fibras de estrés, debilitando las interacciones célula-célula.
La monocapa con interacciones intercelulares interrumpidas está lista para su análisis.
En preparación, configure y calibre el sistema de cultivo celular de hipoxia de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ambiente de la cámara debe ser 95% nitrógeno, 5% dióxido de carbono y 37 grados centígrados. Ahora, desoxigene el dmem libre de glucosa colocándolo en la cámara de hipoxia durante 4 a 6 horas. Más tarde, comience a estresar las células reemplazando su medio con DMEM desoxigenado sin glucosa. Y luego colocando las células en la cámara de hipoxia durante dos horas. Después de dos horas, vuelva a colocar las células en el medio completo de células endoteliales del cerebro de rata. Luego, vuelva a oxigenar las células devolviéndolas a condiciones normales durante una hora.