Inmunoprecipitación de cromatina nativa de células de la neurosfera

Tome las células de la neuroesfera en un tampón que contenga detergentes, calcio e inhibidores de la proteasa.

El detergente permeabiliza las células, mientras que el inhibidor inactiva las proteasas para preservar la proteína diana unida a la cromatina.

Agregue nucleasa e incube. La nucleasa usa calcio para digerir la cromatina.

Agregue un tampón que contenga EDTA que quele el calcio, inactivando la nucleasa.

Agregue tampón de lisis para lisar las células, liberando la cromatina.

Centrifugar y recoger el sobrenadante.

Agregue anticuerpos específicos a la proteína diana e incube con rotación. Centrifugar y eliminar el sobrenadante.

Introducir perlas magnéticas dirigidas al anticuerpo e incubar con rotación.

Agregue tampón de lisis para separar el ADN unido no específicamente.

Capture magnéticamente las perlas y elimine el sobrenadante.

Agregue un tampón con alto contenido de sal para separar las proteínas unidas de forma no específica.

Capture magnéticamente las perlas y elimine el sobrenadante.

Agregue un tampón de estabilización, capture magnéticamente las perlas y elimine los contaminantes.

Vuelva a suspender en un tampón de proteinasa-K para digerir las proteínas, liberando el ADN.

Una vez recolectadas las neuroesferas, centrifugar 1 por 10 a las 6 células de la neuroesfera por inmunoprecipitación a 300 veces g durante 5 minutos. Después de centrifugar, decantar el sobrenadante y volver a suspender el gránulo de neuroesfera en un mililitro de solución salina equilibrada. Transfiera la suspensión a tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros de baja unión a proteínas y luego centrifugue como antes.

A continuación, decanta el sobrenadante y vuelve a suspender el sedimento celular en 95 microlitros de tampón digestivo suplementado de 1 a 100 con cóctel inhibidor de proteasa por 1 por 10 a las 6 células. Pipetea inmediatamente las células hacia arriba y hacia abajo para evitar que se formen grumos y evitar que se formen burbujas. Luego mezcle 5 microlitros de nucleasa microcócica 0.1x y 145 microlitros de tampón de digestión, y agregue 5 microlitros de nucleasa microcócica diluida por 1 por 10 a las 6 células. Mueva el tubo para mezclar y colóquelo en un bloque de calor a 37 grados centígrados durante exactamente 12 minutos.

La digestión de la nucleasa microcócica para fragmentar la cromatina es el paso más crítico. La fragmentación adecuada de la cromatina es importante para lograr una alta resolución para ChIP. Para asegurarse de que este paso sea exitoso, incube varias muestras una a la vez para asegurarse de que no se produzca una digestión excesiva.

Después de 12 minutos, agregue 10 microlitros de tampón de parada de nucleasa microcócica 10x por 1 por 10 a las 6 celdas. Las muestras deben mantenerse en hielo a partir de este momento. El análisis del bioanalizador de la muestra de nucleasa microcócica digerida demuestra que la mayor parte del ADN se ha fragmentado en mono, di y trinucleosomas. A continuación, agregue 110 microlitros de 2x tampón RIPA suplementado de 1 a 100 con cóctel inhibidor de proteasa por 1 por 10 a las 6 células.

Mueva el tubo para mezclar y luego centrifugue durante 15 minutos a 4 grados Celsius y 1,700 veces g. Transfiera el sobrenadante que contiene la cromatina a un tubo de microcentrífuga normal de 1.5 mililitros y colóquelo en hielo. Use tampón RIPA suplementado con inhibidores de proteasa de 1 a 1,000 para diluir la cromatina de modo que cada IP tenga un volumen de 100 a 200 microlitros. Luego elimine una alícuota equivalente al 10% del volumen de ChIP como muestra de entrada.

Prepare la entrada agregando 100 microlitros de tampón TE suplementado con proteinasa-K e incube a 55 grados Celsius durante una hora. Después de purificar la entrada con un kit de purificación por PCR, mida la concentración de la entrada con un espectrofotómetro de microvolúmenes. Registre los resultados en un cuaderno. Agregue 10 microlitros de perlas magnéticas de proteína A y G lavadas por IP que se realizarán en cada muestra e incube durante una hora a 4 grados centígrados con rotación a 20 RPM.

Coloque la muestra en un soporte magnético y deje que las perlas se separen. Luego transfiera el volumen requerido a nuevos tubos de 1,5 mililitros. Agregue el anticuerpo deseado a cada tubo y luego envuelva las tapas con una película de parafina plástica para evitar la evaporación. Incube las muestras durante la noche a 4 grados centígrados con rotación como antes. Al día siguiente, gire los tubos a 2000 veces g durante 10 segundos. Luego agregue 10 microlitros de perlas a cada IP e incube durante tres horas a 4 grados centígrados con rotación a 20 RPM.

Luego coloque las muestras en un soporte magnético y deje que las perlas magnéticas se separen. Use una pipeta para eliminar el sobrenadante. Luego agregue 150 microlitros de tampón RIPA con inhibidores de proteasa a cada IP e incube a 4 grados Celsius a 20 RPM durante 5 minutos. Después del período de incubación, coloque las muestras en un soporte magnético y deje que las perlas magnéticas se separen. Use una pipeta para eliminar el sobrenadante. Luego agregue 150 microlitros de tampón de cloruro de litio suplementado con inhibidores de proteasa a baja concentración a cada IP e incube a 4 grados centígrados con rotación a 20 RPM durante 5 minutos.

Después del período de incubación, coloque las muestras en un soporte magnético y deje que las perlas magnéticas se separen. Luego use una pipeta para eliminar el sobrenadante. Luego agregue 150 microlitros de TE frío sin inhibidores de proteasa a las cuentas e incube a 4 grados centígrados con rotación a 20 RPM durante 5 minutos. Después del paso final de lavado, vuelva a suspender la muestra en 100 microlitros de tampón TE suplementado con la concentración final de 0,5 miligramos por mililitro de proteinasa-K e incube a 55 grados Celsius durante una hora.