Realización de hibridación in situ de doble fluorescencia para detectar la expresión génica en secciones del cerebro de ratón
Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 4:06 min. • April 28th, 2025
Tome una sección de cerebro de ratón fijada químicamente.
Agregue una mezcla de hibridación que contenga un agente de permeabilización y sondas de ARN marcadas con FITC o DIG.
Incubar para permitir la permeabilización celular y la entrada de la sonda.
Las sondas se unen a secuencias complementarias en el ARNm de MBP, un marcador de referencia que se expresa de forma ubicua en oligodendrocitos, o ARNm de ASPA, el objetivo.
Lave para eliminar las sondas sueltas.
Agregue un tampón de bloqueo para evitar la unión de anticuerpos no específicos.
Introducir anticuerpos anti-FITC conjugados con HRP dirigidos a la sonda marcada con FITC.
Lavar, luego agregar FITC-tiramida.
HRP oxida la tiramida FITC en una forma altamente reactiva que se une a las proteínas cercanas, amplificando la señal de fluorescencia.
Lave y vuelva a introducir el tampón de bloqueo.
Agregue anticuerpos anti-DIG conjugados con fosfatasa alcalina dirigidos a la sonda marcada con DIG.
Lavar y aplicar la solución Fast Red.
La fosfatasa alcalina desfosforila Fast Red, produciendo un precipitado fluorescente.
Visualice bajo un microscopio de fluorescencia.
La colocalización de las señales de Mbp y ASPA indica la expresión de ASPA en oligo
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos