Imágenes de alta resolución de los receptores de neurotransmisores en las sinapsis de la retina

Tome una sección de retina de ratón en una cuadrícula de microscopía electrónica. La sección contiene células ganglionares de la retina, o RGC, unidas sinápticamente a las células bipolares. Las

células bipolares presinápticas contienen vesículas de neurotransmisores dispuestas en una estructura de cinta cerca de la membrana sináptica.

Las

RGC postsinápticas muestran receptores de neurotransmisores agrupados en su membrana. Estas células están marcadas con la subunidad B o CTB de la toxina del cólera.

Lavar con un tampón para mantener el pH.

Incubar con un tampón de bloqueo para enmascarar los sitios de unión no específicos.

Incubar con anticuerpos primarios dirigidos a los receptores de neurotransmisores y CTB.

Lavar con un tampón para eliminar los anticuerpos no unidos y mantener el pH.

Incubar con anticuerpos secundarios conjugados con nanopartículas de oro de diferentes tamaños, que se unen a los anticuerpos primarios, marcando las moléculas diana.

Retire los anticuerpos no unidos y luego seque la muestra al aire.

Aplique metales pesados que se unan a las macromoléculas, mejorando el contraste.

Usando microscopía electrónica, identifique las RGC usando los CTB marcados y localice los receptores de neurotransmisores marcados.

En este paso, corte secciones ultrafinas de 70 nanómetros de espesor con un ultramicrotomo y recójalas en las rejillas de níquel recubiertas de carbono Formvar. Lave las rejillas en agua destilada una vez, seguido de tres lavados de TBS. Luego, incube las rejillas en 20 microlitros de BSA al 5% en TBS durante 30 minutos, y luego en 20 microlitros de una mezcla que contenga anti-CTB de cabra y un anticuerpo contra una subunidad NMDAR durante la noche a temperatura ambiente.

Después de eso, lave las rejillas tres veces con 20 microlitros de TBS cada vez a pH 7.6. Posteriormente, lave las rejillas una vez con TBS a pH 8,2 durante cinco minutos. Incubar las rejillas durante dos horas con 20 microlitros de una mezcla que contenga IgG anti-conejo de burro, acoplada a partículas de oro de 10 nanómetros, e IgG anti-cabra de burro acoplada a partículas de oro de 18 nanómetros.

Después de dos horas, lave las rejillas en 20 microlitros de TBS a pH 7,6 tres veces, seguido de un lavado en agua ultrapura. Y luego seque al aire las rejillas. Posteriormente, contratiña las rejillas con acetato de uranilo al 5% en agua destilada durante ocho minutos, seguido de citrato de plomo al 0,3% en agua destilada durante cinco minutos en la oscuridad.