Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 2:52 min. • April 28th, 2025
Comience con una placa de pocillos múltiples que contenga células de mamíferos recombinantes adherentes en una solución de estimulación suplementada con luciferina, un sustrato luminiscente.
Incubate para permitir la entrada de luciferina a la célula.
Estas células expresan receptores odorantes unidos a la membrana junto con proteínas G olfativas y proteínas transportadoras de receptores.
Además, las células expresan proteínas Glosensor citoplasmáticas, proteínas luminiscentes sensibles al AMP cíclico.
Agregue una solución odorante vaporizable en el espacio entre los pocillos y coloque la placa dentro de un instrumento luminómetro preequilibrado con el mismo odorante.
Iniciar la medición de luminiscencia.
Las moléculas odorantes se unen a los receptores odorantes de las células, activando la proteína G acoplada y disociando la subunidad α de la proteína G, o Gα.
La subunidad Gα disociada se une a la enzima adenilato ciclasa incrustada en la membrana, activándola. La enzima activada convierte los ATP en AMP cíclicos.
Estos AMP cíclicos se unen a las proteínas glosensoras, alterando su conformación y permitiendo la unión de la luciferina.
Esta interacción produce luminiscencia, confirmando la activación de los receptores odorantes.
Agregue 75 microlitros de la solución reactiva de cAMP. Retire la solución de estimulación de los pocillos y agregue 25 microlitros de solución reactiva de AMPc diluida a cada pocillo. Incube la placa de 96 pocillos a temperatura ambiente en un ambiente oscuro y sin olores durante dos horas.
Primero, diluya el odorante acetofenona al 1% en 10 mililitros de aceite mineral y tape el tubo. Antes de que finalice el tiempo de incubación del reactivo de AMPc, agregue 25 microlitros de la solución odorante a cada pocillo en una nueva placa de 96 pocillos. Luego coloque esta placa odorante en la cámara del luminómetro durante cinco minutos para equilibrar la cámara con moléculas odorantes volátiles. Configure el luminómetro para registrar la luminiscencia con cero segundos de retraso durante 20 ciclos de medición de placa de 90 segundos, con 0,7 segundos de intervalo entre ciclos.
Justo antes de leer la placa, retire la placa odorante de la cámara. En la placa de 96 pocillos que contiene las células transfectadas, agregue 25 microlitros de odorante en el espacio entre los pocillos y vuelva a colocar rápidamente la placa en la cámara. Inicie la medición de luminiscencia de todos los pocillos durante 20 ciclos en 30 minutos.