Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 3:01 min. • April 28th, 2025
Tome una rata de control anestesiada y un modelo de rata con lesión cerebral inducida por láser.
La aplicación del láser en el hemisferio derecho dañó las células y la barrera hematoencefálica, o BBB, que separa la sangre del tejido cerebral.
Inyecte un tinte de seguimiento en la vena de la cola canulada que viaja a través de la circulación sistémica para llegar al cerebro.
El colorante se une a las proteínas plasmáticas y se filtra en el tejido cerebral a través de la BHE dañada.
Eutanasia a las ratas.
Perfunde las ratas a través del corazón para eliminar el tinte de la circulación.
Extraer y cortar el cerebro, aislar las rodajas del hemisferio lesionado y homogeneizarlas.
Tratar con una solución ácida para desnaturalizar las proteínas, liberando el colorante unido a la proteína.
Centrifugar y aislar el sobrenadante que contiene colorante. Agregue alcohol para mejorar la fluorescencia del tinte.
Transfiere la solución a una microplaca. Tras la excitación, una mayor intensidad de fluorescencia en el cerebro lesionado indica daño BBB inducido por láser.
Para evaluar la incidencia de rotura de la barrera hematoencefálica, 24 horas después de la lesión inducida por láser, cargue una jeringa con colorante azul de Evans al 2%, diluido en 4 mililitros por kilogramo de solución salina, y administre la solución por vía intravenosa a las ratas lesionadas y de control a través de la vena de la cola canulada.
Deje que la solución circule durante una hora, antes de usar juegos de alfileres quirúrgicos y tijeras para abrir el pecho del primer animal. Perfundir el corazón expuesto, con solución salina al 0,9% enfriada a través del ventrículo izquierdo a 110 milímetros de mercurio de presión, hasta que se observe un líquido de perfusión incoloro desde la aurícula derecha.
A continuación, recolecte el cerebro y obtenga cortes rostrocaudales de 2 milímetros. Separe los cortes del cerebro izquierdo de los cortes del cerebro derecho para permitir la evaluación de los hemisferios lesionados y no lesionados por separado, y pese las muestras. Homogeneizar las muestras, utilizando un mortero, e incubar las muestras de tejido en ácido tricloroacético al 50% durante 24 horas.
Al día siguiente, centrifugamos las muestras de tejido cerebral homogeneizado, durante 20 minutos a 10.000 veces g y temperatura ambiente. Mezcle 1 mililitro del sobrenadante con 1,5 mililitros de etanol al 96% en una proporción de 1 a 3. Luego, use un detector de fluorescencia con una excitación de 620 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 680 nanómetros para evaluar la rotura de la barrera hematoencefálica.