Localización de fluorescencia de proteínas de unión estrecha y fibras de estrés en células endoteliales

Tome un portaobjetos con cámara que contenga un cultivo monocapa de células endoteliales microvasculares de cerebro de rata, o RBMEC, que imitan la capa de células endoteliales de la barrera hematoencefálica.

Las células exhiben proteínas de unión estrecha interrumpidas y fibras de estrés de actina debido al estrés de la privación de oxígeno-glucosa seguida de reoxigenación.

Retire el medio y lave las celdas, aplique un fijador para preservar la arquitectura celular y luego lave el exceso de fijador.

Tratar con un detergente para permeabilizar las membranas celulares.

Incubar con un agente bloqueador para enmascarar sitios de unión no específicos.

Para etiquetar proteínas de unión estrecha, incube con anticuerpos primarios específicos y luego elimine los anticuerpos no unidos.

Incubar con anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos para marcar los anticuerpos primarios.

Alternativamente, para etiquetar las fibras de estrés, agregue faloidina etiquetada con fluoróforo.

Wash para eliminar las moléculas de etiquetado no unidas.

Retire la cámara, aplique un medio de montaje que contenga un tinte de unión al ADN fluorescente para teñir los núcleos, luego selle con un cubreobjetos.

Usando microscopía confocal, visualice las proteínas de unión estrecha marcadas con fluorescencia y las fibras de tensión.

Comience exponiendo cada pocillo de monocapas RBMEC a 100 a 200 microlitros de medios de suero reducidos Opti-MEM y continúe su incubación durante una hora. Luego lave los portaobjetos de la cámara tres veces, usando de 100 a 200 microlitros de PBS por pocillo por lavado. Fije las células con paraformaldehído al 4% en PBS e incube los portaobjetos durante 15 minutos a temperatura ambiente. Y lave las células tres veces con PBS como antes.

Ahora, permeabilice las células aplicando de 100 a 200 microlitros de Triton X-100 al 0,5% en PBS a cada pocillo. Y deje que la placa se incube durante otros 15 minutos a temperatura ambiente. Después de que las células se hayan permeabilizado, aplique la solución de bloqueo. Y deje que esto actúe sobre las células durante una hora a temperatura ambiente.

A continuación, realice la inmunofluorescencia para la proteína ZO-1 o etiquete la F-actina. Para realizar la inmunofluorescencia de las células para ZO-1, incubarlas con el anticuerpo primario durante la noche a 4 grados centígrados. Al día siguiente, lave las células tres veces en PBS, como al retirar el fijador. Luego incube las células en 100 a 200 microlitros de anticuerpo secundario anti-conejo FITC tag durante una hora a temperatura ambiente, para marcar las células con faloidina de rodamina.

Después de aplicar la solución bloqueante durante una hora, exponga las células a 100 a 200 microlitros de faloidina de rodamina en una dilución de 1 a 50, con BSA PBS al 2% durante 20 minutos. Después de la incubación de anticuerpos secundarios o faloidina de rodamina, lave las células con PBS tres veces más como antes. Luego retire las cámaras despegando el elástico. Proceda con el montaje de las correderas, utilizando un medio que contenga antidecoloración y DAPI. Obtener imágenes de las células con microscopía confocal en un solo plano con un objetivo de 60x.