Localización de fluorescencia de proteínas de unión estrecha y fibras de estrés en células endoteliales

Tome un portaobjetos con cámara que contenga un cultivo monocapa de células endoteliales microvasculares de cerebro de rata, o RBMEC, que imitan la capa de células endoteliales de la barrera hematoencefálica.

Las células exhiben proteínas de unión estrecha interrumpidas y fibras de estrés de actina debido al estrés de la privación de oxígeno-glucosa seguida de reoxigenación.

Retire el medio y lave las celdas, aplique un fijador para preservar la arquitectura celular y luego lave el exceso de fijador.

Tratar con un detergente para permeabilizar las membranas celulares.

Incubar con un agente bloqueador para enmascarar sitios de unión no específicos.

Para etiquetar proteínas de unión estrecha, incube con anticuerpos primarios específicos y luego elimine los anticuerpos no unidos.

Incubar con anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos para marcar los anticuerpos primarios.

Alternativamente, para etiquetar las fibras de estrés, agregue faloidina etiquetada con fluoróforo.

Wash para eliminar las moléculas de etiquetado no unidas.

Retire la cámara, aplique un medio de montaje que contenga un tinte de unión al ADN fluorescente para teñir los núcleos, luego selle con un cubreobjetos.

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