Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 3:56 min. • April 28th, 2025
Comience con una sección de cerebro de primates no humanos químicamente fijada.
El fijador a base de aldehído reticula las proteínas, preservando la estructura del tejido, pero deja algunos residuos de aldehído reactivos.
Lave para eliminar la capa crioprotectora que rodea la sección de tejido.
Agregue un agente reductor para neutralizar los grupos aldehídos reactivos, produciendo subproductos de reacción.
Lavar para eliminar estos subproductos y el exceso de agentes reductores.
Aplique una solución de bloqueo para evitar la unión de anticuerpos no específicos.
Agregue anticuerpos primarios dirigidos a una proteína expresada en sitios específicos de la membrana neuronal.
Lavar para eliminar los anticuerpos no unidos.
Agregue anticuerpos secundarios biotinilados dirigidos a los anticuerpos primarios.
Lavar para eliminar los anticuerpos no unidos.
Cubra con complejos de avidina-biotina-peroxidasa que se unen a los anticuerpos secundarios.
Lave nuevamente para eliminar los complejos no unidos.
Introducir un sustrato cromogénico junto con el agua oxigenada. En presencia de peróxido de hidrógeno, la enzima peroxidasa oxida el sustrato, formando precipitados marrones.
Comience transfiriendo secciones de 50 micras de espesor de cerebro de primate no humano fijado en acroleína, que contiene la región de interés a una placa de 12 pocillos que contiene PBS. Lave las secciones flotantes tres veces en PBS durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego incube las secciones en una solución de borohidruro de sodio recién preparada durante 30 minutos a temperatura ambiente. Balancea suavemente sin cubrir.
Una vez transcurridos los 30 minutos, aspirar el borohidruro de sodio y añadir PBS a cada pocillo. Coloque el plato en una mecedora y agite vigorosamente durante 10 minutos. Repita el lavado dos veces más, o hasta que no quede nada del gas de reacción. Bloquee las secciones incubando en una solución de suero normal al 2% y gelatina de pescado fría al 0,5%, diluida en PBS durante una hora a temperatura ambiente con un balanceo suave.
Una vez transcurrido el tiempo de incubación, incube las secciones y la solución de anticuerpos primarios con un balanceo suave durante la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, después de lavar las secciones como antes, incube las secciones en una solución de anticuerpos secundarios durante 1,5 horas a temperatura ambiente con un balanceo suave. Después de lavar las secciones como antes, incube en avidina biotina peroxidasa, o solución ABC, durante una hora con balanceo.
A continuación, prepare una solución fresca de 3,3-diaminobenzidina al 0,05% con peróxido de hidrógeno al 0,005% diluido en TBS. Después del lavado, incube secciones en la solución DAB durante tres a siete minutos con un balanceo suave. Una vez que el precipitado marrón se haya desarrollado al color deseado, detenga la reacción lavando rápidamente dos veces en TBS frío, luego a través de una serie de lavados temporizados de TBS y PB.