Tinción inmunohistoquímica de biomarcadores en secciones de la neurosfera de tumores cerebrales

Tome una diapositiva con secciones incluidas en parafina de neuroesferas de tumores cerebrales, grupos de células madre neurales que exhiben biomarcadores de proteínas nucleares específicos del tumor.

Calentar para derretir la parafina, retirarla con xileno y rehidratar el tejido con concentraciones de alcohol decrecientes.

Calentar en un tampón ácido que contenga detergente para desenmascarar los epítopos de los biomarcadores y permeabilizar las membranas celulares.

Enjuagar, luego tratar con un agente oxidante para inactivar las enzimas peroxidasas endógenas, evitando señales inespecíficas.

Aplicar una solución de bloqueo para enmascarar sitios de unión no específicos.

Incubar con anticuerpos primarios dirigidos a los epítopos de biomarcadores.

Enjuague, luego trate con anticuerpos secundarios conjugados con biotina que se unen a los anticuerpos primarios.

Enjuague e incube con una avidina conjugada con enzimas peroxidasas, que se une a la biotina.

Agregue un sustrato cromogénico y un agente oxidante.

Peroxidasa utiliza el agente para convertir el sustrato en precipitados coloreados, etiquetando la ubicación del biomarcador.

Contratiña los núcleos, deshidrata el tejido en alcohol y monta el portaobjetos para obtener imágenes de la distribución de biomarcadores.

Primero, derrita la parafina incubando los portaobjetos en una rejilla de metal a 60 grados centígrados durante 20 minutos. A continuación, desparafinó los portaobjetos mediante incubación en un tren de rehidratación a temperatura ambiente según el protocolo Tex. Guarde los portaobjetos en agua del grifo para evitar la unión inespecífica de anticuerpos. Después de esto, incube los portaobjetos en tampón de citrato a 125 grados Celsius durante 30 segundos a 90 grados Celsius durante 10 segundos. Deje que los portaobjetos se enfríen antes de enjuagarlos cinco veces con agua destilada.

A continuación, incube los portaobjetos a temperatura ambiente en peróxido de hidrógeno al 0,3% durante 20 minutos. Luego, lave los portaobjetos durante cinco minutos tres veces en tampón de lavado con agitación suave. Incube los portaobjetos durante la noche en una cámara humidificada a 4 grados centígrados con anticuerpos primarios diluidos. Después de esto, lave los portaobjetos tres veces durante cinco minutos con agitación suave.

A continuación, incube los portaobjetos en anticuerpos secundarios biotinilados diluidos a temperatura ambiente durante una hora. Lave los portaobjetos tres veces durante cinco minutos en tampón de lavado con agitación suave. Luego, incube los portaobjetos en el complejo de peroxidasa de rábano picante biotinilado con avidina a temperatura ambiente en la oscuridad durante una hora. Repita el lavado como se describió anteriormente. Después de esto, incube los portaobjetos con bandas de sustrato de peróxido de hidrógeno durante dos a cinco minutos a temperatura ambiente.

Enjuague los portaobjetos con agua del grifo y sumérjalos en una solución de hematoxilina para contrateñirlos. Luego enjuague bien los portaobjetos con agua del grifo hasta que el agua salga clara. Deshidratar los portaobjetos según el protocolo Tex. Finalmente, cubra las guías con un medio de montaje a base de xileno y déjelas secar sobre una superficie plana a temperatura ambiente.