Imágenes microscópicas electrónicas de transmisión de la endocitosis de vesículas sinápticas en neuronas del hipocampo de ratón

Comience tratando las neuronas del hipocampo de ratón con un tampón con alto contenido de potasio que contenga peroxidasa de rábano picante o HRP.

El potasio alto despolariza las neuronas presinápticas, desencadenando la exocitosis de las vesículas sinápticas. Luego, las neuronas recuperan las membranas de las vesículas sinápticas a través de la endocitosis, incorporando HRP en las vesículas recién formadas. Fije las neuronas con glutaraldehído y lávelas para eliminar el exceso de glutaraldehído.

Agregue peróxido de hidrógeno y un sustrato cromogénico, que es oxidado por HRP para formar precipitados densos en electrones. Lavar para eliminar cualquier sustrato sin reaccionar.

Tratar con tetróxido de osmio para mejorar el contraste de la membrana, luego lavar el exceso de reactivo. A continuación, agregue acetato de uranilo para mejorar el contraste de orgánulos.

Deshidratar las neuronas utilizando concentraciones crecientes de etanol e incrustarlas en resina.

Identifique microscópicamente las regiones densas en células y elimínelas. Luego, prepare secciones ultrafinas.

Transfiera una sección a una rejilla de cobre y contráñela con agentes de contraste.

Usando microscopía electrónica de transmisión, las vesículas que contienen HRP aparecen como estructuras densas en electrones.

Estimule el cultivo de neuronas del hipocampo agregando 1,5 mililitros de solución de estimulación con alto contenido de potasio a cada pocillo a temperatura ambiente durante 90 segundos. En este paso, prepare un tampón de cacodilato de sodio molar de 0,1 molar a pH 7,4. Fije las células con glutaraldehído al 4% en tampón de cacodilato de sodio molar al 0,1 durante al menos una hora a temperatura ambiente.

Luego, lave las células tres veces con tampón de cacodilato de sodio molar 0.1 cada vez durante siete minutos. A continuación, prepare la solución DAB y fíltrela con el filtro de 0,22 micrómetros. A continuación, aplique 1,5 mililitros de solución DAB a las células durante 30 minutos a 37 grados centígrados.

Luego, lave las células tres veces con tampón de cacodilato de sodio molar 0.1 cada vez durante siete minutos. Como post-fijación, incubar las neuronas con 1,5 mililitros de tetróxido de osmio al 1% en tampón de cacodilato de sodio 0,1 molar durante una hora a cuatro grados centígrados.

Luego, lave las neuronas tres veces con 1,5 mililitros de tampón de cacodilato de sodio 0,1 molar cada vez durante siete minutos. Posteriormente, prepare un tampón de acetato de sodio 0,1 molar con acetato de sodio y ácido acético glacial. Lave las células tres veces con 1,5 mililitros de tampón de acetato molar 0,1 cada vez durante siete minutos.

Después de eso, incube las células con 1,5 mililitros de acetato de uranilo al 1% en tampón de acetato molar 0,1 durante 1 hora a cuatro grados centígrados. Luego, lave las células tres veces con 1,5 mililitros de tampón de acetato molar 0,1 durante siete minutos cada vez. En una campana extractora, deshidrate el cultivo neuronal con lavados individuales de 1,5 mililitros de etanol al 50%, 70% y 90% durante siete minutos cada lavado, seguidos de tres lavados con 1,5 mililitros de etanol al 100% durante siete minutos cada vez.

A continuación, cree la resina epoxi y mezcle bien y guárdela al vacío para eliminar las burbujas de aire. Infiltre la muestra reemplazando el etanol con resina epoxi al 50% en etanol en un agitador durante 30 minutos a temperatura ambiente, luego resina epoxi al 70% y etanol durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador.

Cambie la solución de resina epoxi por resina epoxi 100% e incube durante 10 minutos a 50 grados centígrados. Realice dos intercambios de resina epoxi fresca 100%. Cada intercambio se incuba durante una hora a 50 grados centígrados. Luego, agregue resina epoxi fresca 100% y deje que se endurezca a 50 grados centígrados durante la noche y luego a 60 grados centígrados durante más de 36 horas.

Luego, retire cada muestra de la placa de pocillos múltiples con la sierra de mano del joyero. Con un microscopio de luz invertida, seleccione las regiones de interés que tienen concentraciones densas de células. Luego, corte los bloques de 4 por 5 por 8 milímetros en cubos para seccionarlos. Posteriormente, contratiña las secciones por inmersión con acetato de uranilo acuoso al 1% durante 15 minutos y luego citrato acuoso de plomo al 3% durante 5 minutos para mejorar el contraste de las muestras.