Marcaje retrógrado de neuronas motoras de Drosophila mediante colorantes lipofílicos fluorescentes

Comience con un embrión de Drosophila diseccionado fijado en un portaobjetos de vidrio con cinta adhesiva alrededor.

Las neuronas motoras de la mosca están marcadas con fluorescencia para su visualización.

Con un microscopio, visualice el embrión y coloque una micropipeta lipofílica verde fluorescente llena de colorante cerca del embrión.

A continuación, cambie al modo de fluorescencia y localice la punta axonal de la neurona motora en la unión neuromuscular, donde la neurona motora se conecta con el músculo.

Cambie al modo de campo claro, entre en contacto con la punta del axón objetivo con la pipeta, libere una gota de tinte y luego incube.

Debido a su naturaleza lipofílica y a su proximidad axonal, los colorantes entran selectivamente en la membrana rica en lípidos del axón objetivo.

Con el tiempo, el tinte viaja retrógradamente, moviéndose hacia atrás a lo largo de la bicapa lipídica axonal hacia el cuerpo neuronal, etiquetando las proyecciones neuronales.

Retire la cinta del portaobjetos y coloque un cubreobjetos.

Observe el portaobjetos bajo un microscopio confocal.

La neurona diana etiquetada retrógradamente aparece en fluorescencia verde, mostrando morfología neuronal y proyecciones detalladas.

Use una aguja de vidrio bajo un microscopio de disección para arrastrar el embrión fuera de la membrana vitelina de la cinta al vidrio, teniendo cuidado de no dañar los tejidos interiores del embrión. Luego corte la línea media de un solo embrión en su superficie desde su extremo posterior hasta el anterior. Voltea los tejidos epiteliales desde el centro y fija el borde epidérmico a la superficie del portaobjetos de vidrio.

Use una aguja conectada a un tubo con una abertura de punta de aproximadamente 300 micrómetros para aspirar o soplar aire para eliminar los troncos traqueales longitudinales dorsales, así como las tripas restantes. Use PFA y PBS al 4% para fijar los embriones durante 5 minutos a temperatura ambiente en un agitador orbitario. Luego lávelos tres veces con PBS.

Tiñe los embriones con 1 microlitro de anticuerpo anti-peroxidasa de rábano picante conjugado con colorante de cianina 3 y 200 microlitros de PBS durante una hora en el agitador orbital. Y repita los lavados en PBS. Para llenar la micropipeta de inyección, colóquela en el soporte capilar. A continuación, coloque el portaobjetos de tinte en el escenario y use el micromanipulador para colocarlo sobre el portaobjetos.

A continuación, ajuste la platina para colocar la micropipeta sobre el tinte. Recoja el tinte y la micropipeta ajustando la presión de inyección entre 200 y 500 hectopascales, el tiempo de inyección entre 0,1 y 0,5 segundos y la presión de compensación a 0 durante 5 minutos. Una vez que se haya recolectado el tinte, retire el portaobjetos de tinte y coloque la muestra en la platina del microscopio.

A continuación, aumente la presión de compensación a un rango de 30 a 60 hectopascales y baje la micropipeta en la muestra. Utilice la lente del objetivo 10 veces para localizar el embrión y alinear la micropipeta con el embrión. Cambie la lente del objetivo a una lente de inmersión en agua 40 veces y sumerja la lente en el PBS.

Utilice la microscopía de fluorescencia para comprobar la morfología neuronal marcada por el anti-HRP Cy3 y determinar el lugar de inyección. Cuando el embrión esté enfocado, cambie la posición de la micropipeta para hacer un contacto suave con la punta del axón de interés. Luego, use microscopía de campo claro durante la inyección para ver la gota de tinte. Deje caer el tinte en un hemisegmento abdominal derecho en la unión neuromuscular de ACC o RP3 con DiD o DiO.

Utilice el control manual para liberar el tinte y retirar la micropipeta. Luego pase al siguiente sitio de inyección. Incube la muestra durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador orbital antes de obtener imágenes. Con unas pinzas finas, retire las cintas del portaobjetos de vidrio.

Para montar la muestra, prepare un cubreobjetos con una pequeña cantidad de grasa al vacío en las cuatro esquinas. Colóquelo con cuidado sobre la muestra, asegurándose de evitar burbujas de aire. Empuje hacia abajo el cubreobjetos para ajustar el espacio de la muestra para permitir la distancia de trabajo entre la lente del objetivo y el portaobjetos.

Elimine el exceso de PBS con toallitas de trabajo. Selle completamente los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas. Tome imágenes con 10 y 100 aumentos con un microscopio confocal y procese las imágenes con el software ImageJ.