Imágenes de la activación neuronal del hipocampo en secciones del cerebro de ratón

Comience con secciones del cerebro del ratón que exponen el hipocampo dorsal, rico en neuronas.

Agregue peróxido de hidrógeno para apagar la actividad de la peroxidasa neuronal, seguido de lavado.

Tratar con un tampón de permeabilización, luego aplicar un tampón de bloqueo para bloquear la unión no específica.

Agregue los anticuerpos primarios e incube con agitación. Estos anticuerpos se unen a proteínas marcadoras de activación neuronal.

Lavar y aplicar anticuerpos secundarios conjugados con biotina para unirse a los anticuerpos primarios.

Enjuagar e introducir un complejo avidina-biotina-peroxidasa que se una a la biotina en los conjugados.

Lavar de nuevo, luego agregar un sustrato cromogénico, que es oxidado por la peroxidasa para generar un precipitado marrón. Detenga la reacción con PBS.

Transfiera las secciones a un portaobjetos recubierto de gelatina y deshidrate utilizando concentraciones crecientes de etanol. Luego, limpie las secciones en xileno y móntelas.

Coloque el portaobjetos bajo un microscopio de campo claro.

Bajo la iluminación de la luz, las regiones no teñidas transmiten luz y parecen brillantes, mientras que las neuronas teñidas absorben y reflejan la luz y parecen más oscuras.

La zona más oscura indica la activación neuronal dentro del hipocampo.

Transfiera de tres a cinco secciones dorsales del hipocampo para cada ratón a los pocillos de una placa de 24 pocillos múltiples que contenga 500 microlitros de PBS molar para cada pocillo. Lave las secciones contenidas en cada pocillo con 500 microlitros de PBS 0.1 molar. Realice todos los lavados e incubaciones a temperatura ambiente con agitación suave, a menos que se indique lo contrario. Bajo una campana extractora, incube las secciones en metanol al 40%, peróxido de hidrógeno al 1% en PBS molar 0,1 durante 20 minutos para apagar la actividad peroxidasa endógena.

Después de tres lavados más en PBS 0,1 molares, permeabilice las secciones incubándolas en 500 microlitros de Triton X-100 al 0,2% durante cinco minutos. Mientras las secciones se incuban, prepare suficiente tampón de bloqueo para todo el experimento. Luego, retire la solución de permeabilización y agregue 100 microlitros del tampón de bloqueo a cada pocillo. Incuba las secciones durante una hora.

A continuación, retire el tampón de bloqueo y cubra las secciones con un anticuerpo primario de quinasa regulada extracelular fosforilada, diluido de 1 a 500 en tampón de bloqueo. Incube las secciones durante la noche a 4 grados centígrados con agitación suave. Al día siguiente, después de lavar las secciones tres veces en PBS molar 0,1 durante 5 minutos cada una, incube las secciones con un anticuerpo secundario conjugado con biotina diluido de 1 a 250 tampón de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente.

Durante la incubación, prepare el reactivo ABC al menos 30 minutos antes de su uso para permitir suficiente tiempo para que se forme el complejo de avidina y biotina. Después de lavar las secciones tres veces más con PBS 0,1 molares, agregue el reactivo ABC y déjelo incubar con la muestra durante 45 minutos. Durante la siguiente serie de tres lavados en PBS, prepare la solución de trabajo en la campana extractora de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Alícuota la solución de trabajo en la placa.

Luego, transfiera las secciones a los pocillos que contienen la solución de trabajo DAB y gire lentamente la placa para permitir la máxima exposición de las secciones a la solución. Monitoree la reacción DAB en un microscopio hasta que se desarrolle la señal adecuada en aproximadamente dos a cinco minutos. Detenga la reacción a la intensidad de color deseada lavando el tejido en PBS 0,1 molares. Después de tres lavados más en PBS, monte las secciones en portaobjetos recubiertos de gelatina y séquelos a temperatura ambiente durante al menos tres o cuatro horas.

Una vez secas al aire, transfiera los portaobjetos en la campana extractora y deshidrate las secciones colocándolas secuencialmente en soluciones de etanol graduadas durante dos minutos cada una. Luego, limpie los portaobjetos con xilenos 100% durante cinco minutos. Cubra las diapositivas con un medio de montaje y déjelas secar en la campana extractora durante la noche.

Transfiera los portaobjetos a un microscopio de campo claro equipado con una cámara en lente de objetivo de 20x. Adquiera múltiples imágenes de campo claro de cada sección con un aumento de 200x, cubriendo el hipocampo dorsal. Imagen de tres a cinco secciones de cada animal.