Obtención de imágenes de la dinámica intracelular del ATP mediante sensores basados en FRET en un corte organotípico del hipocampo de un ratón

Asegure un corte organotípico de hipocampo de ratón en una cámara experimental.

El corte contiene neuronas transducidas y astrocitos que expresan un sensor de ATP con proteínas fluorescentes donantes y aceptoras.

Coloque la cámara en una platina de microscopio de fluorescencia y perfunda con ACSF oxigenado.

Permite que el segmento se adapte a las condiciones almacenadas en búfer.

Usando luz de transmisión, enfoca el segmento e identifica el área de interés.

Cambie al modo de fluorescencia y excite la proteína fluorescente donante para iniciar la emisión de fluorescencia.

Tras la unión de ATP, el sensor sufre cambios conformacionales, lo que permite la transferencia de energía basada en fluorescencia del donante al aceptor, que emite fluorescencia a una longitud de onda más larga.

Utilice un espejo dicroico y filtros de paso de banda para aislar y separar las emisiones donantes y aceptoras.

Seleccione una región sin fluorescencia para la sustracción de fondo. Luego, identifique las células diana y registre su fluorescencia a lo largo del tiempo.

Calcule la relación FRET para monitorear los niveles de ATP intracelular en tiempo real.

Prepare ACSF experimental y obtenga un pH de 7,4 burbujeánd