Imágenes in vivo de dos fotones de la retina del ratón

Tome un ratón transgénico anestesiado con la cabeza asegurada en ángulo sobre un soporte para obtener imágenes in vivo de la retina del ratón.

La retina contiene células ganglionares de la retina, o RGC, que expresan una proteína marcada con fluoróforos.

Aplicar lubricante ocular y montar un cubreobjetos sobre el ojo.

Bajo un microscopio, ilumine uniformemente la retina para excitar las proteínas fluorescentes en las RGC.

Utilizando la fluorescencia emitida, obtenga una vista de campo amplio de las RGC del plano focal y las RGC desenfocadas.

Cambie al modo de imagen de dos fotones, enfocando la luz infrarroja cercana de baja energía en la capa RGC.

En el punto focal, la energía combinada de dos fotones excita el fluoróforo, que luego libera energía en forma de fluorescencia.

Como la excitación se limita a un solo punto, se minimiza la fluorescencia de otros planos focales.

Capture imágenes en múltiples planos focales a lo largo del eje z para obtener imágenes de toda la capa RGC.

Aplique gotas lubricantes para los ojos en ambos ojos del ratón. Gire el brazo principal del soporte de la cabeza hasta que la pupila de un ojo esté orientada en línea con la trayectoria de la luz y coloque un cubreobjetos número 1.5 en el portafiltros compacto. Después de asegurar el soporte a la platina del microscopio, baje el cubreobjetos hasta que entre en contacto con el lubricante i-gel sin tocar la córnea. Y ajuste la platina en la dimensión xy y la posición z del objetivo hasta que la luz de excitación de campo amplio cubra completamente la córnea.

Use el ocular para continuar ajustando la posición z, hasta que las células o estructuras fluorescentes de la retina se enfoquen, aumentando el iluminador de epifluorescencia según sea necesario para resolver células o estructuras individuales de interés. Ajuste la alineación de la retina con la trayectoria de la luz de imagen. Ajuste el ángulo de la cabeza hasta que solo se produzca la expansión o contracción de la luz desenfocada al cambiar el plano focal, minimizando las distorsiones xy.

Luego apague el iluminador de epifluorescencia y cierre el obturador del iluminador. Para imágenes de dos fotones, siga todos los protocolos de seguridad láser institucionales. Apague y cubra toda la luz ambiental y cambie la trayectoria de la luz de excitación al láser y la trayectoria de la luz de emisión a los PMT.

En el software de adquisición de imágenes, establezca el tamaño del fotograma en 512 por 512 y el promedio del fotograma en 3. Configure el z-stepping para que comience en la parte superior de la pila y progrese hacia abajo, minimizando la activación del láser de dos fotones de los fotorreceptores. Encienda y habilite los PMT y ajuste el voltaje a 680 voltios.

Habilite los obturadores de imágenes y emisiones. Comience una vista previa de la imagen en vivo del tejido objetivo a partir de una potencia láser del 1% y ajuste automáticamente el brillo de la pantalla para visualizar las células o estructuras de interés. Si el tejido objetivo es tenue o poco claro, aumente el porcentaje de potencia del láser hasta que las estructuras se vuelvan visibles sin exceder los 45 milivatios.

Maniobre la platina del microscopio en la dirección xy para centrarse en un área de imagen deseada y navegue hasta el plano z, con las estructuras de interés enfocadas. Para un experimento crónico de lapso de tiempo, abra una imagen obtenida previamente para usarla como referencia para las células de interés, teniendo cuidado de que el ángulo de imagen en la imagen actual sea similar al de las imágenes anteriores. A continuación, navegue hasta los planos z superiores e inferiores de interés para establecer los límites z de la pila de imágenes y adquirir la imagen.