Imágenes de fluorescencia de la dinámica neuroinmune mediante un implante de cráneo

Comience con un ratón transgénico anestesiado con una ventana circular de imágenes de vidrio y una placa de cabeza implantada en su cráneo.

Las células microgliales o inmunes y las neuronas están marcadas con proteínas fluorescentes.

A continuación, asegure el ratón en la platina del microscopio de dos fotones.

A continuación, inyecte un tinte fluorescente por vía intraperitoneal para teñir los vasos sanguíneos de rojo.

Limpie la ventana de imágenes de vidrio, aplique una gota de solución salina y baje el objetivo del microscopio.

A continuación, configure la luz láser para capturar una imagen de los vasos sanguíneos. Registre el patrón de ramificación y las coordenadas para localizar y obtener imágenes de la misma región más adelante.

Ahora, configure el láser para excitar las proteínas fluorescentes, haciendo que la microglía y las neuronas emitan fluorescencia.

Usando el patrón de ramificación registrado, ubique la misma región y capture regularmente imágenes de las células.

La red vascular y las neuronas permanecen estables, mientras que los cambios en la posición microglial a lo largo del tiempo reflejan la dinámica inmune en respuesta a la actividad neuronal.

Taladre una abertura circular de aproximadamente 4 milímetros en el cráneo con una broca dental. Durante la perforación, humedezca regularmente el cráneo con solución salina estéril e hisopos de algodón para enfriar el cerebro. Limpie los restos óseos y ablande el hueso del cráneo.

Cuando termine, retire con cuidado esta parte del cráneo con pinzas puntiagudas. Después de extraer el cráneo, coloque con cuidado un pequeño cubreobjetos humedecido con solución salina en la craneotomía. Seque el exceso de solución salina con una toallita estéril. Con un aplicador puntiagudo, aplique pegamento de cianoacrilato alrededor de la ventana y deje que se adhiera al cerebro y al cráneo.

Aplica el pegamento de imprimación al resto del cráneo y cúralo con una luz de polimerización durante 20 a 40 segundos. Crea un hueco alrededor de la ventana con el pegamento final y cúralo con una luz de curado durante 20 a 40 segundos. Pegue una pequeña placa de cabeza en el cráneo en el hemisferio contralateral de la craneotomía con el pegamento de cebado, y luego, con el pegamento final, cure ambos durante 20 a 40 segundos.

Después de que el ratón se despierte, inyecte una dosis subcutánea de buprenorfina SR como analgesia postoperatoria, que será suficiente durante 72 horas. Proporcione al ratón comida extra blanda para facilitar una recuperación saludable. Las imágenes se pueden realizar tan pronto como dos semanas después de la cirugía de implantación. Use tornillos para montar la placa de cabeza en la platina del microscopio de dos fotones, que debe mantenerse a 35 grados centígrados con una placa calefactora.

Inyecte al ratón por vía subcutánea 100 microlitros de tinte para vasos sanguíneos, como rodamina B. Limpie suavemente la superficie de la ventana craneal con un hisopo de algodón humedecido en etanol al 70%. Ponga unas gotas de agua o solución salina en la ventana y baje la lente del objetivo en la solución. Asegúrese de que el láser esté apagado mientras el objetivo está bajando.

Dibuje a mano un mapa del curso para indicar los principales puntos de referencia de los vasos sanguíneos, mientras mira a través del ocular. Utilice este dibujo para identificar las regiones específicas durante la obtención de imágenes de dos fotones. Recopile imágenes de células y vasos fluorescentes utilizando imágenes de dos fotones. Consulte el manuscrito de texto para conocer los parámetros de imagen. Tome notas cuidadosas con las coordenadas adecuadas para asegurarse de que las regiones precisas se puedan volver a visitar para obtener imágenes posteriores.

Recopile varios campos de visión en esta sesión inicial de imágenes.