Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 2:48 min. • May 29th, 2025
Comience con una configuración de microscopio de fluorescencia que contiene un diafragma inmovilizado con nervios frénicos de un ratón transgénico.
La unión neuromuscular del diafragma consta de una neurona motora, una fibra muscular y células de Schwann que contienen receptores de acetilcolina y canales de calcio.
Estas células tienen receptores de acetilcolina marcados con fluorescencia y expresan indicadores de calcio intracelular.
Un divisor de imágenes conectado a la configuración permite la visualización simultánea de ambas señales fluorescentes.
El nervio frénico se coloca en un electrodo de succión para administrar estímulos eléctricos.
Bajo el microscopio de fluorescencia, visualice los receptores de acetilcolina para identificar una unión neuromuscular.
Para establecer una fluorescencia basal máxima, agregue una solución de cloruro de potasio para despolarizar la membrana celular temporalmente. Esto desencadena la afluencia de calcio intracelular, lo que provoca un aumento en la fluorescencia de los indicadores.
Ajuste la configuración de brillo para evitar la sobresaturación de la señal de fluorescencia.
Después de la repolarización, aplique estimulaciones eléctricas para desencadenar la entrada de calcio en la célula y registre el cambio en la fluorescencia intracelular a una alta velocidad de fotogramas.
Con un aumento de 20 veces, ubique la banda de la placa terminal en el centro del músculo buscando uniones neuromusculares de alfa-bungarotoxina marcadas con fluorescencia bajo excitación de luz verde amarilla. Cambie a la excitación de luz azul para obtener imágenes de las respuestas de calcio en los músculos, las neuronas motoras o las células de Schwann. En este ejemplo, GCaMP 3 se expresa en las células musculares.
Si lo desea, configure el divisor de imagen con filtros de paso de banda y filtro dicroico de borde único para la obtención de imágenes de doble longitud de onda. Realice experimentos con la barra de brillo en la barra de la tabla de búsqueda, establecida en el 110% del nivel en el que el indicador de calcio codificado genéticamente que expresa tejido exhibe saturación a 20 veces el aumento, sin agrupar en respuesta al cloruro de potasio.
Grabe a 20 fotogramas por segundo para no perderse ningún evento rápido. Estimule con 1 a 45 segundos de 20 a 40 hercios de estimulación nerviosa administrando un tren de impulsos con un electrodo de succión. Y recolecta respuestas dinámicas de calcio fluorescente en un subtipo de célula, junto con la señal de unión neuromuscular de alfa-bungarotoxina estática marcada con fluorescencia.