Cuantificación de neuronas recién generadas en tejido cerebral de rata mediante la técnica del fraccionador óptico

Tomemos como ejemplo los cortes de cerebro del hipocampo de una rata inyectada con bromodeoxiuridina, o BrdU, un análogo nucleósido de la timidina.

BrdU se integra en el ADN durante la división celular, marcando las neuronas recién generadas dentro de la circunvolución dentada, una región para la neurogénesis.

Incubar con un agente oxidante para inactivar las enzimas peroxidasas endógenas.

Tratar con ácido para desnaturalizar el ADN y exponer BrdU, luego neutralizar el ácido.

Incubar con un detergente para permeabilizar las membranas celulares y una solución de bloqueo para enmascarar sitios de unión no específicos.

Incubar con anticuerpos primarios dirigidos a BrdU, seguidos de anticuerpos secundarios marcados con peroxidasa específicos para los anticuerpos primarios.

Introducir un sustrato cromogénico y un agente oxidante, permitiendo que la peroxidasa convierta el sustrato en un residuo coloreado.

Monte el tejido y contratiñe con un tinte de unión a ácidos nucleicos.

Deshidrate el tejido, luego trátelo para aumentar la transparencia.

Bajo un microscopio, identifique la circunvolución dentada.

Usando la técnica del fraccionador óptico, analice múltiples planos a través del grosor del teji