Cuantificación de neuronas recién generadas en tejido cerebral de rata mediante la técnica del fraccionador óptico

Tomemos como ejemplo los cortes de cerebro del hipocampo de una rata inyectada con bromodeoxiuridina, o BrdU, un análogo nucleósido de la timidina.

BrdU se integra en el ADN durante la división celular, marcando las neuronas recién generadas dentro de la circunvolución dentada, una región para la neurogénesis.

Incubar con un agente oxidante para inactivar las enzimas peroxidasas endógenas.

Tratar con ácido para desnaturalizar el ADN y exponer BrdU, luego neutralizar el ácido.

Incubar con un detergente para permeabilizar las membranas celulares y una solución de bloqueo para enmascarar sitios de unión no específicos.

Incubar con anticuerpos primarios dirigidos a BrdU, seguidos de anticuerpos secundarios marcados con peroxidasa específicos para los anticuerpos primarios.

Introducir un sustrato cromogénico y un agente oxidante, permitiendo que la peroxidasa convierta el sustrato en un residuo coloreado.

Monte el tejido y contratiñe con un tinte de unión a ácidos nucleicos.

Deshidrate el tejido, luego trátelo para aumentar la transparencia.

Bajo un microscopio, identifique la circunvolución dentada.

Usando la técnica del fraccionador óptico, analice múltiples planos a través del grosor del tejido para cuantificar las neuronas marcadas con BrdU.

Cuando esté listo para comenzar, la inmunotinción, permita que las secciones alcancen la temperatura ambiente. Luego, use un pincel para transferir cada quinta sección de una serie de secciones del hipocampo a redes de tinción de 25 pocillos colocadas en placas de Petri llenas de PBS. Debe haber de 8 a 12 secciones por hipocampo para la tinción. Transfiera las redes de tinción, que contienen las secciones, a platos de vidrio correspondientes, que contengan PBS, y lave las secciones dos veces durante 10 minutos en PBS.

Luego, incube en peróxido de hidrógeno al 3% durante 20 minutos. Después del lavado, mueva las secciones a través de tres soluciones de ácido clorhídrico. Luego, neutralice en tetraborato de sodio 0.1 molar a temperatura ambiente durante 20 minutos.

Después de tres incubaciones de 10 minutos en cambios de tampón de lavado, transfiera las secciones a la solución de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente. Luego, incube las secciones en anti-BrdU de ratón, diluidas de 1 a 100 en solución de bloqueo durante 48 horas a 4 grados centígrados.

Después de la incubación primaria de anticuerpos, lave tres veces durante 10 minutos cada una en tampón de lavado, luego incube durante 48 horas en peroxidasa de rábano picante, diluida de 1 a 10 en tampón de lavado. 48 horas después, transfiera las secciones a PBS durante 10 minutos y repita durante un total de cinco lavados. Después del lavado, transfiera las secciones a la solución DAB durante siete minutos. Luego, transfiera a una solución DAB que contenga peróxido de hidrógeno al 0,02% durante 10 minutos.

Después de una serie de lavados, monte las secciones en orden numérico en portaobjetos de microscopio. Deje secar durante aproximadamente 30 minutos. Luego, seque al aire las muestras colocándolas en una rejilla para portaobjetos. A continuación, rehidrate las muestras durante 10 minutos en un plato de tinción de portaobjetos que contenga agua destilada.

Luego, transfiera los portaobjetos a un 0,02% de violeta cristalina en agua destilada durante 15 minutos. Después de repetir la tinción violeta cristalina, rehidrate las secciones a través de una serie de etanol. Luego, limpie las secciones en xileno dos veces durante 15 minutos cada vez. Finalmente, agregue un medio de montaje de secado rápido y cubra las correderas.

Después de 24 horas, los portaobjetos se pueden utilizar para microscopía. Comience por verificar el grosor del tejido colocando primero los portaobjetos en la platina motorizada del microscopio y luego abriendo el software de estereología. Delinee el área de interés utilizando un objetivo de bajo aumento antes de cambiar a un objetivo de inmersión en aceite de 100x.

A continuación, elija un punto específico en el marco de contabilidad, por ejemplo, un área adyacente a una esquina, y ubique la parte superior de la sección moviéndose a lo largo del plano focal hasta que alguna característica de la sección aparezca enfocada. Registre esta posición z como 0. A continuación, mueva el plano focal hacia abajo a través del tejido hasta que el último nivel z de tejido esté enfocado, luego marque esta posición. El grosor del tejido local se define de 0 a este punto final y se puede leer en el eje z.

Registre el grosor del tejido. El grosor del tejido se mide en varios lugares dentro de la región de interés. La altura del disector y las zonas de guardia, el tamaño del conteo, el marco, la longitud del paso y el aumento final se determinan en un estudio piloto. Ahora, puede comenzar a contar las neuronas BrdU positivas, generalmente con un aumento final de 2,000 a 3,000x, usando un objetivo de aceite de 60x o aceite de 100x y una apertura numérica alta.

Identifique las neuronas BrdU positivas en cada marco de conteo, pero no cuente las que tocan la línea roja de exclusión. Cuente las neuronas BrdU positivas que tocan la línea de inclusión verde y las que caen dentro del límite del marco de conteo. Solo cuente las neuronas BrdU positivas cuando la característica de interés se reconozca claramente dentro de la altura del disector. Las neuronas semivisibles que se muestran aquí no se cuentan.