Imágenes en vivo del ojo de la pupa de Drosophila mediante microscopía de fluorescencia

Comience con una pupa de Drosophila transgénica con un ojo expuesto.

Coloque la pupa en una cuenta de gelatina dentro de un marco de papel hidratado, rodeado por un anillo de gelatina.

El ojo de la pupa contiene proteínas de unión marcadas con GFP que resaltan los límites celulares en el neuroepitelio del ojo en desarrollo.

Presione suavemente un cubreobjetos sobre la región de los ojos de la pupa.

Bajo un microscopio fluorescente, las uniones marcadas con GFP emiten fluorescencia, mostrando la organización del neuroepitelio.

Tome imágenes a intervalos regulares a diferentes profundidades y procese las imágenes para mejorar el contraste y minimizar el ruido de fondo.

Alinee estas imágenes con intervalos de tiempo crecientes para rastrear el neuroepitelio en desarrollo.

Inicialmente, las células primarias forman límites alrededor de los grupos de células fotorreceptoras, mientras que las células interommatidiales o IC se organizan en una sola capa.

Más tarde, los CI se diferencian en células secundarias y terciarias cerca de los fotorreceptores.

Finalmente, el exceso de CI se elimina mediante la muerte celular programada, formando una red hexagonal que estructura el ojo organizado.

Con fórceps, levante y retire con cuidado el opérculo para exponer la cabeza de la pupa. Luego, rasgue a lo largo del costado de la caja de pupa para exponer el área alrededor de un ojo. Retire suavemente la pupa de la cinta adhesiva.

Construye un pequeño marco de 15 milímetros cuadrados con papel secante y haz un agujero de 5 milímetros en el medio. Sumerja el marco en agua destilada y colóquelo en el centro de un portaobjetos de microscopio. Con una jeringa de 30 cc, exprima un anillo uniforme de vaselina para rodear el marco de papel secante.

A continuación, agregue una pequeña gota de vaselina directamente sobre el portaobjetos. Coloque con cuidado la pupa de lado y apóyela con la perla de vaselina. Coloque un cubreobjetos en la parte superior del anillo de vaselina para que entre en contacto con el epitelio sobre el ojo. Comprima suavemente la preparación para sellar el cubreobjetos contra la vaselina y genere una superficie de contacto pequeña y plana entre la región de los ojos de la pupila y el cubreobjetos.

Obtén imágenes de la preparación de la pupa con un microscopio fluorescente. Capture secciones seriadas a través del dominio apical del neuroepitelio ocular en la región de la unión adherente cada siete minutos. Utilice el software de deconvolución adecuado para reducir el fondo y mejorar el contraste de las imágenes de la sección en serie.

Para cada archivo de pila z en el software LAS AF, vaya al panel Herramientas, seleccione Deconvolución 3D y haga clic en Aplicar. Genere una proyección máxima, o imagen MP, para cada archivo de pila deconvoluto. Alinee cada imagen MP para resaltar los comportamientos de las células individuales y reducir las distracciones causadas por el crecimiento del organismo, utilizando los algoritmos integrados en Photoshop CS5.

En la pestaña Archivo del menú principal, abra Scripts y seleccione Cargar archivos en la pila. A continuación, importe los archivos de imagen MP en el panel Cargar capas. Asegúrese de que la opción Intentar alinear automáticamente las imágenes de origen no esté seleccionada, de lo contrario, los datos de la imagen pueden distorsionarse. Una vez que todos los archivos MP se hayan cargado en el panel de capas, compruebe que todas las imágenes estén en orden cronológico y que el punto de tiempo más antiguo esté en la parte superior de la pila de capas. Arrástrelos y suéltelos hasta que estén ordenados correctamente si es necesario.

A continuación, seleccione Alinear capas automáticamente. Elija Reposicionar y haga clic en Aceptar.