JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociencia
0 vistas • 2:39 min • May 29th, 2025
Comience con una larva de pez cebra que contiene células de interneuromast o INMC marcadas con fluorescencia, montadas en un cubreobjetos y colocadas bajo un microscopio confocal.
Los INMC son células progenitoras con capacidad regenerativa que han sido sometidas previamente a ablación con láser.
Primero, observe el área dañada en modo fluorescencia. La ausencia de fluorescencia confirma el éxito de la ablación con láser.
A continuación, utilice el modo de imagen de luz transmitida para examinar el área dañada donde la célula parece granular e hinchada con núcleos irregulares, lo que confirma la muerte celular.
El reclutamiento de macrófagos en el sitio indica una respuesta celular activa a la lesión.
Ahora, vuelva al modo de fluorescencia y capture imágenes de lapso de tiempo a intervalos regulares para monitorear la recuperación.
Durante la fase de recuperación, los INMC extienden las proyecciones en el espacio, lo que facilita el cierre y promueve la reparación celular.
Guarde estas imágenes de series de tiempo para su análisis. La reaparición de fluorescencia distinta en el área ablacionada confirma una recuperación celular exitosa.
Para obtener imágenes de los cuerpos celulares después de la ablación, en el menú Canales, desmarque la pista DAPI para desactivar el láser de ablación y abra el menú del modo de adquisición. Haga clic en Zoom y disminuya el zoom a 0,7.
Para evaluar el éxito de la ablación celular, escanee rápidamente el campo de visión. Con la misma configuración que para la imagen previa a la ablación, capture y guarde una imagen posterior a la ablación. Inspeccione la imagen del canal del tubo fotomultiplicador de luz transmitida para confirmar aún más el daño celular. Las células dañadas demostrarán una apariencia granular y los núcleos con frecuencia se hincharán o parecerán irregulares.
Para evaluar la recuperación del cuerpo celular posterior a la ablación, active las opciones de posición y tiempo de la etapa para la captura de imágenes de lapso de tiempo, y establezca los parámetros de tiempo en el punto de tiempo experimental apropiado y en intervalos de 15 minutos. A continuación, inicie el experimento para adquirir imágenes y guarde el archivo resultante cuando haya terminado.