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Tome una cámara de imágenes que contiene tejido del plexo mientérico colónico de ratón inmovilizado, que alberga plexos ganglionares compuestos por redes de neuronas entéricas y células gliales.
Estas células están marcadas con un indicador de calcio que emite fluorescencia al unirse al calcio.
A continuación, coloque la cámara en una platina de microscopio de fluorescencia. Perfunda la cámara con un tampón precalentado que contenga inhibidores para suprimir las contracciones musculares durante la obtención de imágenes.
Usando un microscopio, identifique las regiones ganglionares sanas que exhiben fluorescencia uniforme.
Adquiera imágenes fluorescentes para medir la actividad de referencia, proporcionando una referencia para los niveles de calcio intracelular.
Perfunde el tejido con un agonista del receptor para activar los receptores neuronales, lo que desencadena la entrada de calcio intracelular y un aumento en la intensidad de la fluorescencia.
La activación neuronal estimula indirectamente las células gliales circundantes, lo que lleva a la entrada de calcio y un posterior aumento de la fluorescencia.
Capture imágenes fluorescentes de lapso de tiempo para medir los cambios en la intensidad de la fluorescencia, que indican la dinámica del calcio y la actividad de señalización tanto en las neuronas como en las células gliales en relación con los niveles de referencia.
Durante la incubación, haga un tampón de Kreb modificado de acuerdo con las instrucciones en la parte escrita del protocolo y agregue 3 micromolares de nicardipina y 1 micromolar de escopolamina para inhibir las contracciones musculares durante las imágenes de calcio 2 plus en disecciones de montaje completo. Coloque la cámara de registro bajo el microscopio fluorescente y, utilizando un sistema de perfusión por flujo por gravedad con múltiples depósitos de jeringa calentados, establezca una velocidad de perfusión continua de 2 a 3 mililitros por minuto de tampón de Kreb de 37 grados Celsius. Asegúrese de evitar la formación de burbujas de aire en ambos y en la línea de succión conectada a una trampa de vacío. Enfoque el plexo deseado bajo iluminación de campo claro. Evite sobreexponer el tejido, lo que puede provocar fotoblanqueo.
Examine la carga de fluoróforos dentro de los ganglios y seleccione ganglios sanos para obtener imágenes. Los ganglios dañados no saludables exhibirán autofluorescencia o morfología punteada y no deben usarse para obtener imágenes. Una vez seleccionado un ganglio, desvíe la trayectoria de la luz hacia la cámara y obtenga una imagen en vivo con el software de adquisición de imágenes. Asegúrese de que el ganglio esté enfocado y establezca la velocidad de adquisición de imágenes y los tiempos de exposición.
Las tasas y los tiempos de adquisición de imágenes variarán según los eventos que los investigadores deseen registrar. Para la mayoría de los experimentos, las imágenes se adquieren tradicionalmente a 0,5 a 1 hercios para las células gliales y hasta 2 a 10 hercios para las neuronas, porque los transitorios de calcio glial no son tan rápidos como las neuronas transitorias de calcio.
Inicie la grabación y establezca la actividad fisiológica de referencia del ganglio elegido en ausencia de estímulos experimentales durante 30 segundos. Luego aplique medicamentos precalentados de interés, como agonistas y antagonistas de receptores, utilizando el sistema de perfusión de flujo por gravedad a una velocidad de 2 a 3 mililitros por minuto de acuerdo con un protocolo optimizado para su medicamento. Detenga la grabación y vea la película de lapso de tiempo del experimento.
Seleccione cuidadosamente las regiones de interés, o ROI, utilizando el software de análisis de imágenes adecuado.
Finalmente, use el software de imágenes apropiado para normalizar y comparar la intensidad de fluorescencia de las regiones de interés con su valor inicial de referencia. Los cambios en la fluorescencia normalizada son directamente proporcionales a los cambios en el calcio.
