Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 3:08 min. • May 29th, 2025
Comience con una tapa de placa de Petri que contenga el cerebro larvario de Drosophila, preexpuesto a un ciclo de luz / oscuridad. La rebanada contiene neuronas de reloj que expresan proteínas fluorescentes.
Agregue un medio rico en nutrientes con antibióticos para apoyar la supervivencia neuronal y una solución tibia de fibrinógeno.
Mezcle suavemente la solución para distribuir el fibrinógeno de manera uniforme.
Coloque una pequeña cantidad de esta mezcla en el cubreobjetos de un plato con fondo de vidrio.
Agregue trombina para reaccionar con el fibrinógeno e inducir la formación de una matriz de fibrina tridimensional.
Transfiera el cerebro a esta matriz, colocándolo en la parte anterior hacia abajo para alinear las neuronas del reloj para la obtención de imágenes.
Dobla la matriz sobre el cerebro para anclarla y prevenir el movimiento.
Agregue un medio rico en nutrientes para inactivar la actividad de la trombina.
Selle el plato con una membrana permeable al gas para mantener la hidratación y la viabilidad neuronal.
Realice imágenes de fluorescencia de lapso de tiempo a intervalos específicos.
Los cambios de fluorescencia en las neuronas del reloj revelan su activación e inhibición rítmica, sincronizada con el ciclo de luz / oscuridad, reflejando los ritmos circadianos, el ciclo de actividad diaria.
Después de transferir el cerebro a una solución de trabajo, dispense el cerebro y el medio en la tapa de una placa de Petri estéril. Luego agregue otros 3,5 microlitros de SAM con antibióticos y agregue 3,5 microlitros de SAM tibio con fibrinógeno.
Es importante mantener el medio SAM con fibrinógeno a 37 grados durante este procedimiento.
A continuación, mezcle la solución alrededor del cerebro pipeteando suavemente con la misma punta de pipeta y aspire 2 microlitros de la solución para depositarla en un cubreobjetos para un plato con fondo de vidrio. Luego, agregue 0,8 microlitros de trombina a la gota y mezcle muy rápidamente para inicializar la polimerización, que aparecerá blanca. Luego, use fórceps para recoger suavemente el cerebro y colocarlo en la matriz de fibrina polimerizante.
Agregar la trombina después de que el cerebro se transfirió a la gota. No se recomienda ya que complica mucho el procedimiento.
Oriente el cerebro según sea necesario y empuje muy suavemente el cerebro lo más cerca posible del cubreobjetos. Luego elija una capa de fibrina polimerizada y dóblela sobre el cerebro, usando movimientos pequeños y suaves que no desprendan la matriz. Continúe doblando capas de fibrina polimerizada sobre el cerebro de diferentes partes del coágulo para estabilizar el cerebro. Luego deposite 20 microlitros de SAM con antibióticos sobre el cerebro incrustado para detener la actividad de la trombina. Luego coloque un trozo de membrana de PTFE sobre el medio y pegue los bordes de la membrana a las partes engrasadas del plato.