Visualización de la afluencia de calcio en las neuronas ventrales del mesencéfalo derivadas de embriones de ratón

Tome un cubreobjetos con un cultivo de neuronas ventrales del mesencéfalo derivadas de embriones de ratón.

Las células se infectan con un vector viral para expresar un indicador de calcio.

Transfiera el cubreobjetos a la cámara de grabación de un microscopio confocal perfundido con un tampón de grabación.

Usando luz visible, identifique una región que contenga múltiples neuronas, luego cambie a imágenes de fluorescencia.

A niveles bajos de calcio intracelular, el indicador permanece libre y exhibe una baja intensidad de fluorescencia.

Las propiedades intrínsecas de las neuronas generan potenciales de acción espontáneos, lo que hace que los canales de calcio dependientes de voltaje se abran y permitan la entrada de calcio.

El exceso de calcio se une al indicador, induciendo un cambio conformacional que aumenta la intensidad de la fluorescencia.

Registre la intensidad de la fluorescencia a lo largo del tiempo para rastrear la actividad espontánea del calcio.

Introducir un neurotransmisor a alta concentración, que se une a los receptores de las neuronas, generando potenciales de acción continuos.

La activación sostenida del canal de calcio dependiente de voltaje prolonga la entrada de calcio, provocando un aumento sostenido de la intensidad de la fluorescencia.

Prepare 1 litro del tampón de registro HEPES, 200 mililitros de tampón de registro de glutamato de 20 micromolares y 200 mililitros de tampón de registro NBQX de 10 micromolares de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Llene una placa de Petri milimétrica estéril con 3 mililitros del tampón de grabación.

Tome la placa de Petri con los cultivos infectados de la incubadora, luego agarre con cuidado el borde de un cubreobjetos con pinzas de punta fina y transfiéralo a la placa con el tampón de grabación. Vuelva a colocar el cubreobjetos restante en medio en la incubadora a 37 grados Celsius y transporte el plato con tampón de grabación al microscopio confocal.

Inicie el software de imágenes. Mientras se inicializa, inicie la bomba peristáltica y coloque la línea en el búfer de grabación. Luego calibre el flujo a 2 mililitros por minuto. Transfiera el cubreobjetos infectado de la placa de Petri al baño de registro con pinzas finas. Usando el objetivo de inmersión en agua 10x y la luz de campo claro, encuentre el plano de enfoque y busque una región con una alta densidad de cuerpos celulares neuronales. Luego cambie al objetivo 40X y vuelva a enfocar la muestra.

Seleccione y aplique Alexa Flour 488 en la ventana de lista de tintes. Para evitar la sobreexposición y el fotoblanqueo de los fluoróforos, comience con configuraciones de baja potencia de láser y HV. Para el canal Alexa Fluor 488, configure el HV en 500, la ganancia en 1x y el desplazamiento en cero. Establezca la potencia en 5% para la línea láser 488, aumente el tamaño del orificio a 300 micrómetros y use la opción de escaneo focus x2 para ajustar de manera óptima las señales de emisión a niveles de subsaturación.

La configuración se puede ajustar para una visibilidad óptima de cada canal. Una vez que se optimizan los ajustes del microscopio, mueva la platina para localizar una región con múltiples células que muestren cambios espontáneos en la fluorescencia de GCaMP6f y concéntrese en el plano deseado para la obtención de imágenes. Utilice la herramienta recortar rectángulo para recortar el fotograma de imagen a un tamaño que pueda alcanzar un intervalo de fotogramas de poco menos de un segundo. Establezca la ventana de intervalo en un valor de 1,0 y la ventana Num en 600.

Para capturar un vídeo de la serie t, seleccione la opción de tiempo y, a continuación, utilice la opción de escaneo XYt para comenzar la creación de imágenes. Observe la barra de progreso de imágenes y mueva la línea del tampón de registro HEPES al tampón de registro de glutamato de 20 micromolares en el punto de tiempo apropiado. Cuando se complete la creación de imágenes, seleccione el botón Serie terminada y guarde la película de la serie t terminada. Continúe perfundiendo el glutamato durante cinco minutos más, de modo que las neuronas cultivadas hayan estado expuestas al glutamato durante un total de 10 minutos.

Repita este proceso para cada cubreobjetos que se vaya a fotografiar. Es posible ver rastros de calcio en cuerpos celulares neuronales inmediatamente después del experimento. Utilice la herramienta de elipse para dibujar el número deseado de ROI alrededor del soma neuronal y use el botón de análisis de series para visualizar los rastros. Después de la exposición adicional de cinco minutos al glutamato, retire el cubreobjetos del baño con pinzas finas y vuelva a colocarlo en la placa de Petri con el tampón de grabación hasta que se completen todas las imágenes.