Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 3:41 min. • May 29th, 2025
Tomemos un cultivo neuronal del hipocampo de rata a corto plazo que representa neuronas jóvenes y un cultivo a largo plazo que representa neuronas envejecidas.
Las neuronas envejecidas exhiben una mayor densidad de canales de calcio dependientes de voltaje de tipo L, o L-VGCC, que permanecen abiertos durante más tiempo tras la despolarización de la membrana.
Incube con un indicador de calcio fluorescente que se difunda en las células, luego lávese para eliminar cualquier exceso de tinte.
Coloque los cultivos en una cámara de perfusión bajo un microscopio de fluorescencia.
Introducir una solución que contenga neurotransmisores que se unan a los receptores de las neuronas, induciendo la afluencia de iones de sodio y desencadenando la despolarización de la membrana.
La despolarización activa los L-VGCC, lo que permite la entrada de calcio en el citoplasma.
En el cultivo a largo plazo, la mayor densidad y la apertura prolongada de L-VGCC conducen a una sobrecarga de calcio, un sello distintivo del envejecimiento neuronal.
La unión del calcio al indicador genera fluorescencia, y las neuronas envejecidas exhiben una mayor intensidad de fluorescencia, lo que refleja un aumento de los niveles de calcio intracelular tras la estimulación.
En este procedimiento, incube las células con Fura2-AM durante 60 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad, luego transfiera los cubreobjetos a la cámara de perfusión. Después de eso, coloque la cámara de perfusión con el cubreobjetos en el soporte del microscopio invertido. Seleccione el campo microscópico y perfunda las células continuamente con HBS precalentado.
Posteriormente, epiilumine las células a 340 y 380 nanómetros en última instancia, luego registre la luz emitida a 520 nanómetros cada 5 a 10 segundos con una cámara de fluorescencia, que es filtrada por un espejo dicroico Fura-2. Analizar las imágenes fluorescentes grabadas. En primer lugar, abra el archivo del experimento.
Con el software AquaCosmos, haga clic en Relación y seleccione el rango de relación deseado. Calcule la proporción píxel a píxel en las imágenes resultantes para obtener una secuencia de imágenes de proporción. Luego reste el fondo ajustando el botón de iluminación de fondo. Después de eso, presione Iniciar cálculo. a continuación, presione el botón All Time Sequence y borre los ROI antiguos.
Para el análisis cuantitativo de células individuales, establezca nuevos ROI o los ROI correspondientes a las neuronas individuales. Para graficar las grabaciones individuales, exporte los valores de fluorescencia de relación correspondientes a cada ROI al programa de laboratorio de origen haciendo clic en Grabar. A continuación, haga clic en Calcular y guarde el archivo TXT. Después de eso, haga el cálculo correspondiente para estimar el tamaño del aumento en la relación de fluorescencia en respuesta a cada estimulación.