Visualización tridimensional de una infección por el virus de la rabia en tejido cerebral de ratón

Tome una sección cerebral gruesa fija de un ratón infectado con el virus de la rabia.

El virus infecta las neuronas y se replica, lo que da como resultado proteínas virales presentes dentro de las células.

Tratar con un detergente para permeabilizar las membranas celulares y una solución bloqueadora para enmascarar los sitios de unión no específicos.

Incubar con anticuerpos primarios dirigidos a las proteínas virales, seguidos de anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos que se unen a los anticuerpos primarios.

Tratar con un tinte fluorescente de unión a ácidos nucleicos para etiquetar el núcleo.

Deshidrate el tejido en concentraciones crecientes de alcohol, luego aplique una solución aclarante para aumentar la transparencia del tejido para obtener imágenes.

Monte la sección en una cámara de imágenes, llénela con la solución aclarante y séllela.

Usando microscopía de barrido láser confocal, obtenga imágenes del tejido por separado usando las etiquetas fluorescentes, luego combínelas para crear una imagen bidimensional.

Adquiera imágenes en diferentes planos focales en el tejido y combínelas para generar una representación tridimensional para evaluar la progresión de la infección.

Para la inmunotinción de las secciones de tejido cerebral, lavar las muestras dos veces durante 1 hora en 4 mililitros de Tritón X-100 al 0,2% en PBS, seguido de permeabilización durante dos días a 37 grados Celsius, en 4 mililitros de Tritón X-100 al 0,2%, dimetilsulfóxido al 20% y glicina molar al 0,3% en PBS. Bloquee cualquier unión inespecífica con 4 mililitros de Triton X-100 al 0,2%, dimetilsulfóxido al 10% y suero normal al 6% en PBS durante dos días a 37 grados Celsius.

Al final de la incubación de bloqueo, etiquete las muestras con 2 mililitros de solución de anticuerpos primarios durante cinco días a 37 grados centígrados, refrescando la solución de anticuerpos después de dos días y medio. A continuación, lave las muestras durante un día en 4 mililitros de heparina Tween 20 al 0,2% y 10 microgramos por mililitro en PBS, intercambiando el tampón de lavado al menos cuatro o cinco veces durante el transcurso del día y dejando el lavado final durante la noche.

Al día siguiente, incubar las muestras en 2 mililitros de solución de anticuerpos secundarios durante cinco días a 37 grados centígrados. Luego, lave las muestras en 4 mililitros de heparina fresca al 0,2% Tween 20 y 10 microgramos por mililitro en PBS como se demuestra.

Para la tinción nuclear de las muestras, incubar las muestras en 4 mililitros de la tinción de ácido nucleico TO-PRO-3 durante 5 horas, protegidas de la luz. Al final de la incubación, lavar las muestras en 0,2% Tween 20 y 10 microgramos por mililitro de heparina en PBS como se ha demostrado, seguido de deshidratación en una serie ascendente de terc-butanol durante 2 horas por inmersión.

Después de la inmersión al 90%, transfiera las muestras a una solución de terc-butanol al 96% durante la noche. A la mañana siguiente, deshidrate aún más las muestras en terc-butanol al 100% durante 2 horas antes de limpiar las secciones de tejido en BABB-D15 recién preparado durante 2 a 6 horas hasta que estén ópticamente transparentes. Las muestras se pueden almacenar en BABB-D15, protegidas de la luz hasta su montaje y obtención de imágenes.

Para el montaje de muestras, utilice una impresora 3D para imprimir una cámara de imágenes y una tapa. Monte un cubreobjetos de 30 milímetros de diámetro en la cámara de imágenes con caucho de silicona vulcanizador a temperatura ambiente de un componente. Del mismo modo, monte un cubreobjetos de 22 milímetros en la tapa. Use un hisopo de algodón humedecido con agua para eliminar el exceso de caucho de silicona en ambos anillos antes de dejar que el caucho se cure durante la noche.

Al día siguiente, coloque una muestra en la cámara de imágenes y agregue un pequeño volumen de BABB-D15 a la cámara antes de insertar la tapa. Con una aguja hipodérmica, llene la cámara con BABB-D15 a través de la entrada y tape la entrada antes de sellar la cámara de imágenes con caucho de silicona.

Para configurar la adquisición de imágenes, seleccione las líneas láser apropiadas para los fluoróforos utilizados y ajuste los rangos de detección de cada detector para evitar la superposición de señales entre canales. A continuación, establezca los parámetros de adquisición, defina el borde superior e inferior de la pila y adquiera la pila de imágenes.

Para generar proyecciones 3D de la pila de imágenes, abra los archivos de imagen en Fiji y seleccione Imagen, Color, herramienta Canales, Más y Dividir canales para dividir las imágenes combinadas en canales individuales. Para la corrección de la decoloración de las imágenes de cada canal, seleccione Imagen, Ajustar, Corrección de decoloración y seleccione Proporción simple. Utilice los controles deslizantes para ajustar el brillo y el contraste de cada canal y seleccione Imagen, Color y Combinar canales. Marque la opción Crear compuesto.

Convierta la imagen a formato RGB y seleccione Imagen, Pilas y proyecto 3D para generar una proyección 3D. Seleccione el punto más brillante como método de proyección y establezca el espaciado de sectores para que coincida con el tamaño de paso Z de la pila de imágenes adquirida. Para obtener la máxima calidad, establezca el incremento del ángulo de rotación en 1 y habilite la interpolación. Modifique la rotación total, los umbrales de transparencia y la opacidad según sea necesario. Luego guarde la proyección 3D como . TIFF y .AVI formatos de archivo.