Visualización de proyecciones de neuronas motoras y ramificación de axones mediante microscopía de fluorescencia de lámina de luz

Tome un segmento de tejido químicamente fijado y eliminado de un embrión de ratón transgénico que expresa proteína verde fluorescente (GFP) en las neuronas motoras espinales.

Monte el tejido verticalmente en una punta de pipeta modificada.

Conecte la punta a un capilar asegurado dentro del microscopio de fluorescencia de lámina de luz.

Coloque una cámara de muestra llena de tampón debajo del tejido para sumergirlo y eliminar los residuos.

Usando un software de imágenes, alinee el tejido en la trayectoria de la luz.

Comience la adquisición de imágenes.

La fuente de luz emite una fina lámina de luz láser, excitando las GFP en un solo plano del tejido para emitir fluorescencia.

Un detector colocado perpendicular a la trayectoria de la luz captura la fluorescencia emitida.

Adquirir imágenes de las neuronas motoras espinales para generar una reconstrucción 3D de la morfología de ramificación axonal.

Utilice software para mapear axones, identificando patrones de ramificación y puntos finales para evaluar el crecimiento y la conectividad de las neuronas motoras.

Configure la óptica de iluminación 5X/0.1 y la óptica de detección 5X/0.16. Ensamble el soporte de muestras y el capilar de muestras. Prepare la cámara de muestras llenándola con una solución aclarante. Para montar el embrión, prepare una punta de pipeta P200 cortando la parte superior para que se ajuste al diámetro del capilar y retire la parte puntiaguda para la fijación de la muestra.

A continuación, derrita el extremo romo de la punta de la pipeta con una llama pequeña. Apaga la llama y fija rápidamente el embrión verticalmente en el extremo derretido. Coloque la parte superior de la punta de la pipeta con el capilar de la muestra y coloque la cámara de muestra preparada en el microscopio. Con el software de imágenes, seleccione Localizar capilar en la pestaña Localizar y ajuste los ejes xy y z.

A continuación, seleccione Localizar muestra y amplíe a 0,6X para enfocarse en el embrión. Deje que el tampón de la cámara se equilibre con el embrión durante algún tiempo para eliminar cualquier residuo o burbuja. Para la adquisición de imágenes en la pestaña Adquisición, defina los parámetros de la trayectoria de la luz, como los objetivos de detección, el filtro de bloqueo láser, el divisor de haz, las cámaras y los láseres.

Marque la casilla de verificación de escaneo dinámico para ver la reducción de sombras. Luego, defina la configuración de adquisición, profundidad de bits a 16 bits. Amplíe el rango entre 0,36 y 0,7X de iluminación de un solo lado o iluminación de doble lado. Haga clic en Continuo y establezca la intensidad del láser, el tiempo de exposición, la potencia del láser y la posición de la hoja de luz. Posteriormente, presione detener para finalizar la adquisición de imágenes.

Es importante asegurarse de que la muestra transparente se coloque dentro de la trayectoria de luz más corta para permitir la adquisición detallada de imágenes de estructuras verticales finas en nervios motores individuales.

Para la adquisición multidimensional, defina la pila Z moviendo la posición Z para la primera y la última imagen. Haga clic en Óptimo para establecer el número de segmento. A continuación, haga clic en Iniciar experimento para adquirir la pila Z seleccionada. Cuando haya terminado, guarde la imagen en formato CZI de puntos.

Para cuantificar la arborización de axones, abra el archivo de imagen en el software de análisis de imágenes. Ajuste el color, el brillo y el contraste de la imagen mediante la ventana de ajuste de la pantalla para detectar filamentos en función del contraste de intensidad local. A continuación, haz clic en el icono Añadir nuevos filamentos y selecciona el algoritmo de ruta automática en el menú desplegable. Seleccione la región de interés.

A continuación, defina los puntos inicial y semilla asignando las medidas de diámetro más grandes y más delgadas, que se pueden medir utilizando el modo de corte. Asigne un punto de partida en el borde de la región de interés. Para lograr la adición o eliminación manual de puntos de partida, primero, cambie el modo de puntero, Navegar por selección y, a continuación, cambie y haga clic con el botón secundario en los puntos de interés.

A continuación, seleccione Umbrales manuales para puntos semilla para asegurarse de que toda la arboricultura visible esté marcada. A continuación, agregue o quite puntos de inicialización manualmente. Active la casilla Eliminar segmentos desconectados y elimine los puntos de semilla alrededor de los puntos de partida. Posteriormente, ajuste el Umbral para la resta de fondo y finalice el proceso.

Es necesario eliminar los artefactos de fondo y confirmar que la ruta del detector refleja la arborización axónica real para una cuantificación precisa.

Al final, elija el estilo y el color deseados. En la pestaña Estadísticas, seleccione detallado y use los puntos terminales de las dendritas con número de filamentos para cuantificar las terminales nerviosas motoras como indicador de arborización de axones motores. Luego, exporte la imagen del axón reconstruido como un archivo . TIFF.