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Neurociencia
0 vistas • 3:34 min • May 29th, 2025
Comience con secciones tangenciales prefijadas de las secciones corticales del cerebro aplanadas. Lavar para eliminar los rastros de fijador.
Tiñir las secciones con una solución de diaminobenzidina o DAB y sulfato de níquel-amonio.
El DAB se difunde en las neuronas corticales y reacciona con la citocromo oxidasa en las mitocondrias, formando un precipitado oscuro. El sulfato de níquel-amonio oscurece el precipitado, mejorando el contraste.
Agregue paraformaldehído para detener la reacción de tinción, luego enjuague.
Monte las secciones en un portaobjetos y deshidrate con lavados con etanol.
Enjuague con isopropanol y xileno para despejar la sección y mejorar la transmisión de luz.
Aplique un medio de montaje y coloque un cubreobjetos sobre él.
Cuando se obtienen imágenes bajo un microscopio de campo claro, dentro de las neuronas corticales, los precipitados absorben y dispersan la luz, haciéndolos parecer oscuros.
Por el contrario, las áreas despejadas y sin teñir transmiten luz y parecen brillantes.
Este contraste resalta los módulos corticales como estructuras oscuras e irregulares sobre un fondo más claro, que representan grupos neuronales activos involucrados en el procesamiento de información sensorial.
Lave el tejido de la sección en tampón HEPES durante 15 minutos con agitación suave. Durante el lavado, prepare una solución de tinción de citocromo oxidasa fresca y agregue el componente DAB justo antes de usarla. Ahora, incube las secciones en la solución de tinción recién hecha a temperatura ambiente con un agitador. Y vigila. Dependiendo de la cantidad de fijación, la tinción podría observarse en 10 minutos o puede tardar varias horas.
Si la reacción va demasiado lenta, aumente la temperatura a 37 grados centígrados. Para detener la reacción, transfiera las secciones a un baño de PFA al 4% y déjelas incubar durante 15 minutos con agitación suave. Luego, lave las secciones tres veces con tampón HEPES durante 10 minutos por lavado.
Ahora, monte y seque las secciones en portaobjetos de vidrio y deshidrate con baños de etanol progresivamente más fuertes. Luego, lave los portaobjetos en isopropanol durante 5 minutos, seguido de xileno durante cinco minutos. Después del baño de xileno, agregue inmediatamente un medio de montaje sin base de agua de endurecimiento rápido. Los medios a base de agua degradarán la mancha. Después de agregar un cubreobjetos, guarde las diapositivas a 4 grados Celsius hasta que se visualicen.