JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociencia
0 vistas • 4:38 min • May 29th, 2025
Tome células aisladas de los nervios ciáticos y los ganglios de la raíz dorsal de ratón o DRG.
Incube con anticuerpos marcados con fluoróforo contra CD45 y CD11b, y con anticuerpos marcados con biotina contra MHC clase II, para marcar las células inmunitarias.
Incubar con estreptavidina marcada con fluoróforo que se une a la biotina.
Tratar con un fijador para estabilizar la estructura celular.
Introduzca un tampón de permeabilización con una tinción de ADN fluorescente para permeabilizar las membranas y etiquetar los núcleos.
Usando un citómetro de flujo, pase las células a través del rayo láser para evaluar las características ópticas y de fluorescencia.
Elimine los agregados con una mayor fluorescencia de ADN para aislar células individuales y detectar la fluorescencia de los marcadores.
Identificar células que expresan CD45, un marcador característico de las células inmunitarias, confirmando su presencia.
La mayoría de las células CD45 positivas en el DRG expresan CD11b y MHC clase II, lo que indica células similares a la microglía, que están ausentes en los nervios ciáticos.
Esta técnica complementa las imágenes para analizar la heterogeneidad de las células inmunitarias dentro de los tejidos nerviosos.
En la computadora, seleccione los canales apropiados para la detección de los fluoróforos de interés, el caudal apropiado para las muestras y el número total de eventos que se recopilarán por muestra. El número mínimo de eventos debe ser de 1 millón.
A continuación, cree diagramas de dispersión en una hoja de trabajo global de la dispersión lateral A frente a la dispersión directa A, así como para cada fluoróforo de interés frente a la dispersión directa A. Además, cree una vista estadística que mostrará el número de eventos y la intensidad media de fluorescencia para los fluoróforos seleccionados.
Determine la puerta principal P1 basándose en el diagrama de dispersión de los controles de tinción solo DAPI. Adjunte la muestra a la citometría de flujo y haga clic en Adquirir. Observe el gráfico DAPI versus FSC y reduzca el voltaje del canal azul del Pacífico de ADN hasta que la población DAPI-plus se haga visible. Con la herramienta de compuerta rectangular, dibuje un cuadro alrededor de la población DAPI-plus. Esto representa la puerta P1. Seleccione los diagramas de dispersión para cada uno de los fluoróforos y muestre solo los eventos DAPI-plus. Esto representa la fluorescencia de fondo para cada uno de los fluoróforos.
Usando la herramienta de compuerta rectangular, dibuje un cuadro en los diagramas de dispersión para cada uno de los fluoróforos, comenzando en 103 en el eje y. Esta puerta representa la región en la que se deben encontrar eventos positivos para cada uno de los marcadores indicados. Ajuste los voltajes para cada uno de los fluoróforos utilizando los controles de tinción solo DAPI. Adjunte la muestra a la citometría de flujo y haga clic en Adquirir.
Observe la posición de la población DAPI-plus para cada uno de los fluoróforos y ajuste los voltajes respectivos de modo que las poblaciones caigan fuera de la puerta rectangular. Una vez que se haya configurado el citómetro de flujo, ejecute las muestras y exporte los archivos de dispersión directa para su posterior análisis.