Ablación selectiva con láser de una sola neurona en una larva de pez cebra utilizando un microscopio confocal

Tome una solución de agarosa precalentada que contenga una larva de pez cebra transgénica anestesiada que exprese una proteína fluorescente en las neuronas motoras espinales.

Transfiera la larva a un plato de vidrio con un anillo de agarosa.

Con un microscopio, gire la larva de lado. Luego, deje que la agarosa se solidifique, inmovilizando la larva.

Agregue tampón que contenga anestésico para mantener la anestesia.

Coloque el plato en la platina del microscopio confocal y use imágenes de campo claro para localizar la región dorsal de la médula espinal.

Cambie al modo de fluorescencia para visualizar las neuronas motoras fluorescentes.

Determine el plano z central del soma celular para una orientación precisa de la ablación.

Configure los parámetros de imagen para una adquisición de alta resolución minimizando el fotodaño.

Una vez que el plano z deseado esté enfocado, realice la ablación en la región de la neurona diana utilizando un láser ultravioleta enfocado.

La energía láser altera las estructuras celulares, causando pérdida de fluorescencia y muerte celular. La pérdida irreversible de fluorescencia confirma una ablación precisa sin afectar a las células circundantes.

Use una pipeta