Ablación selectiva con láser de una sola neurona en una larva de pez cebra utilizando un microscopio confocal

Tome una solución de agarosa precalentada que contenga una larva de pez cebra transgénica anestesiada que exprese una proteína fluorescente en las neuronas motoras espinales.

Transfiera la larva a un plato de vidrio con un anillo de agarosa.

Con un microscopio, gire la larva de lado. Luego, deje que la agarosa se solidifique, inmovilizando la larva.

Agregue tampón que contenga anestésico para mantener la anestesia.

Coloque el plato en la platina del microscopio confocal y use imágenes de campo claro para localizar la región dorsal de la médula espinal.

Cambie al modo de fluorescencia para visualizar las neuronas motoras fluorescentes.

Determine el plano z central del soma celular para una orientación precisa de la ablación.

Configure los parámetros de imagen para una adquisición de alta resolución minimizando el fotodaño.

Una vez que el plano z deseado esté enfocado, realice la ablación en la región de la neurona diana utilizando un láser ultravioleta enfocado.

La energía láser altera las estructuras celulares, causando pérdida de fluorescencia y muerte celular. La pérdida irreversible de fluorescencia confirma una ablación precisa sin afectar a las células circundantes.

Use una pipeta ajustable para extraer una larva y dejar que se hunda hasta el fondo de la punta. Deje caer la larva en un volumen mínimo de líquido en agarosa precalentada, luego extraiga el pescado con agarosa y dispense rápidamente en un plato de 35 milímetros con fondo de vidrio previamente preparado. Bajo un microscopio de disección, use un pincel estándar para colocar al animal, o varios animales, dentro de la agarosa de lado, de modo que el cuerpo y la cola queden planos.

Deje reposar el pescado incrustado durante 10 a 15 minutos hasta que la agarosa esté firmemente endurecida. Luego, use aproximadamente dos mililitros de agua de huevo con trikane para rellenar cuidadosamente la placa de Petri de 35 milímetros. Coloque la placa de Petri con una larva incrustada en la platina del microscopio confocal y, con iluminación de campo claro y aumento de 40X, enfoque el lado dorsal de la médula espinal del animal. Cambie a una configuración fluorescente adecuada y visualice la estructura de interés para confirmar que todos los parámetros de imagen son los necesarios para la ablación posterior.

Para determinar el grosor de la estructura para la ablación con láser UV, use la unidad Z para verificar la parte superior e inferior de la estructura de interés enfocando manualmente hacia arriba y hacia abajo. Registre manualmente el plano Z que se ablacionará, por ejemplo, el centro de la celda. Para llevar a cabo la ablación con láser, inicie el asistente FRAP haciendo clic en el menú desplegable en la parte superior del menú del software.

En la nueva ventana, determine los parámetros de imagen para el enfoque de ablación seleccionando el formato, la velocidad de escaneo y el promedio. Si aún no se ha seleccionado el plano Z para la ablación, presione el botón en vivo y enfoque a través de la muestra hasta que la estructura fluorescente o el plano Z deseado para la ablación esté enfocado. Una vez que se establecen los parámetros generales de la imagen, acceda al paso de blanqueo para controlar los componentes específicos de la ablación, luego active el láser de 405 nanómetros activándolo para el procedimiento de blanqueo.

A continuación, utilice la opción de zoom para maximizar la intensidad del blanqueo con el ROI seleccionado reduciendo el campo de escaneo, maximizando así el tiempo de permanencia. Seleccione una o varias ROI para la ablación utilizando cualquiera de las herramientas de dibujo de la ventana de adquisición de imágenes. Apunte al montículo del axón, por ejemplo, con la herramienta de dibujo circular de aproximadamente 4 a 8 micrómetros.

Después de establecer el ROI, seleccione el botón de curso de tiempo y confirme el número de ciclos en los que se escanearán y eliminarán los ROI. Elija los fotogramas previos y posteriores a la decoloración según lo desee para permitir una visión general de toda la imagen justo antes e inmediatamente después del proceso de decoloración.

Estos ajustes permiten a los investigadores múltiples capas de refinamiento. A través del ajuste de la potencia del láser, la velocidad de escaneo, el promedio de línea, el tamaño de la región de interés y las repeticiones, esta técnica ofrece un alto grado de libertad para causar estrés o muerte en células individuales.

Después de establecer todos los parámetros de ablación necesarios, presione Ejecutar experimento y controle la eficiencia de la ablación. Consulte el protocolo de texto para obtener más detalles.