Imágenes de fluorescencia dual para identificar oligodendrocitos diferenciados

Tome un cultivo de células precursoras de oligodendrocitos (OPC), aisladas del cerebro de un cachorro de rata, que han sido inducidas a diferenciarse en oligodendrocitos. Las células se fijan para preservar la arquitectura celular.

Los oligodendrocitos diferenciados expresan la proteína básica de mielina, o MBP, un marcador de oligodendrocitos maduros, mientras que tanto las OPC como las células diferenciadas expresan el factor de transcripción de oligodendrocitos 2, u Olig2.

Aplicar una solución bloqueadora de la permeabilización e incubar con agitación, permeabilizando las membranas celulares y bloqueando los sitios de unión no específicos.

Agregue anticuerpos primarios dirigidos a los marcadores e incube con agitación para permitir la unión.

Lave para eliminar los anticuerpos no unidos, luego agregue diferentes anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos específicos para los anticuerpos primarios e incube con agitación.

Lave las células y luego colóquelas en un sistema de imágenes de fluorescencia dual.

Utilice la luz de longitudes de onda específicas para excitar los distintos fluoróforos y detectar las señales emitidas para visualizar los marcadores.

Identificar oligodendrocitos diferenciados que expresan olig2 y MBP entre las OPC indiferenciadas que expresan solo olig2.

Lleve el plato a temperatura ambiente. Aspire los pocillos y agregue 250 microlitros de DPBS que contengan 5% de NGS y 0,1% de Triton X-100. Incube la placa a temperatura ambiente durante una hora con una suave agitación orbital. Prepare la solución de incubación primaria diluyendo el anticuerpo monoclonal anti-MBP de ratón y el anticuerpo anti-OLIG2 policlonal de conejo en DPBS que contenga NGS al 5%. Luego, incube los anticuerpos primarios a 4 grados Celsius durante la noche durante 16 a 18 horas con una suave agitación orbitaria.

Mientras lava la placa, prepare la solución de incubación secundaria diluyendo los anticuerpos anti-ratón 680 y anti-conejo 800 en DPBS que contienen 5% de NGS. A continuación, aspire el lavado final y agregue 250 microlitros de solución de incubación secundaria. Proteja la placa de la luz e incube a temperatura ambiente durante una hora con una suave agitación orbital.

Después de eso, escanee la placa utilizando un sistema de imágenes capaz de detectar emisiones de fluorescencia de 700 nanómetros y 800 nanómetros. Como punto de partida, establezca el desplazamiento focal en 3 y las sensibilidades en 1.5 para MBP, 5.0 para actina y 3.5 para OLIG2. Ajuste los valores de sensibilidad según sea necesario para evitar la sobreexposición de la señal.