Medición de la expresión de proteínas en el cerebro de roedores mediante fluorescencia de infrarrojo cercano y escaneo de alta resolución

Tome un portaobjetos de vidrio que contiene secciones de tejido cerebral de rata inmunoteñidas para los receptores AMPA y NMDA en las neuronas de la amígdala.

Los receptores AMPA median la afluencia de sodio inducida por glutamato y la transmisión sináptica excitatoria rápida.

Por el contrario, los receptores NMDA median la afluencia de sodio y calcio inducida por glutamato y coagonistas, lo que facilita la transmisión sináptica excitatoria lenta.

Los receptores se tiñen con anticuerpos primarios y se detectan utilizando anticuerpos secundarios marcados con fluoróforos en el infrarrojo cercano.

Coloque el portaobjetos con el lado del pañuelo hacia abajo en la interfaz de escaneo infrarrojo cercano.

Ajuste los parámetros de imagen y comience a obtener imágenes.

Tras la iluminación láser, los fluoróforos de los receptores AMPA y NMDA emiten fluorescencia.

Las imágenes del infrarrojo cercano minimizan la autofluorescencia, mejorando la claridad de la señal.

El escaneo de alta resolución garantiza además una clara diferenciación de las señales de fluorescencia, lo que permite una visualización precisa de los receptores AMPA y NMDA cercanos en la amígdala.

Usando software de imágenes, calcule la relación de intensidad de fluorescencia AMPA / NMDA en una región específica de interés como marcador de aprendizaje y memoria.

Coloque las diapositivas en la interfaz de escaneo de infrarrojo cercano con el tejido hacia abajo. Imagen de varias diapositivas a la vez con una herramienta de selección. Imagen de las diapositivas utilizando la configuración de mayor calidad, con una resolución de 21 micrómetros. En un desplazamiento de 0 nanómetros, importe imágenes al software de análisis de imágenes para verlas y marcarlas para el análisis semicuantitativo de proteínas.

Después de abrir el software de análisis de imágenes, seleccione el área de trabajo en la que se escaneó la imagen. A continuación, abra la imagen escaneada en el software de análisis de imágenes para ver el escaneo y ajustar las longitudes de onda, el contraste, el brillo y la ampliación que se muestran sin alterar la imagen sin procesar o la emisión cuantificada total.

Después de identificar las regiones clave para la cuantificación, seleccione la pestaña Análisis en la parte superior de la página y, a continuación, seleccione Dibujar rectángulo para dibujar un rectángulo sobre el área que se cuantificará. Para ver el tamaño del rectángulo, seleccione Formas en la parte inferior izquierda de la pantalla. Luego, seleccione Columnas en la parte inferior derecha. A continuación, agregue las columnas Height y Width para identificar el tamaño de la forma. Finalmente, nombra la forma y repite. Una vez muestreadas todas las regiones, continúe con la combinación y el análisis de los datos disponibles en la pestaña Columnas.