Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 5:37 min. • May 29th, 2025
Comience con una sección de tejido epidérmico de la piel que contiene fibras nerviosas intraepidérmicas o IENF, terminaciones neuronales sensoriales delgadas.
Las IENF son ricas en mitocondrias, proporcionando energía para la transmisión de señales neuronales.
El tejido tiene IENF, mitocondrias y núcleos epidérmicos marcados con fluorescencia.
Usando un microscopio confocal invertido, adquiera secuencialmente señales fluorescentes discretas en longitudes de onda apropiadas para los núcleos, IENF y mitocondrias.
Active un escaneo en vivo para capturar la señal IENF, que abarca la capa epidérmica.
Luego, realice un escaneo secuencial para cada señal para eliminar la diafonía de la señal de fluorescencia.
A partir de la imagen combinada, utilizando el software, recorte y aísle las células epidérmicas fluorescentes azules.
Luego, procese el área recortada para mejorar la resolución de las señales IENF verdes y las señales mitocondriales rojas.
A continuación, genere una imagen de superficie en 3D para crear una máscara para los IENF, luego superponga la imagen de la superficie mitocondrial para aislar las mitocondrias específicas de los nervios.
En el resultado final, los IENF aparecen en cian, mientras que las mitocondrias aparecen como pequeñas estructuras de color magenta.
Seleccione el objetivo de inmersión en aceite de 40x en un microscopio confocal de barrido láser invertido. Seleccione los láseres y detectores apropiados para obtener imágenes de los núcleos, las fibras nerviosas y las mitocondrias. Introduzca los siguientes parámetros de escaneo en la resolución de intensidad de 12 bits del software del microscopio. Velocidad de escaneo de 600 Hz con promedio de dos cuadros y zoom de 2.2. Configure el software del microscopio para una resolución lateral optimizada seleccionando una resolución de escaneo de 1024 por 1024. Optimice la resolución axial y el corte óptico seleccionando una apertura confocal de una unidad aireada con un tamaño de paso z de 210 nanómetros.
Escanee cada señal por separado y ajuste el voltaje y el desplazamiento del detector para eliminar los píxeles saturados por encima y por debajo. Active un escaneo en vivo para la señal nerviosa y ajuste el control de enfoque z para encontrar y establecer los planos focales superior e inferior en el software del microscopio que abarcan la señal nerviosa dentro de la sección de tejido. Escanee la serie z final con escaneo secuencial para eliminar la diafonía de la señal fluorescente.
Aísle la epidermis del estrato córneo y la dermis dibujando una región alrededor de la epidermis, utilizando una herramienta de selección en una imagen duplicada de la imagen original. Luego recorta la imagen a la selección. Calcule las funciones de dispersión de puntos para las señales confocales de fluorescencia verde y roja, utilizando la función de cálculo de la función de dispersión. Luego establezca los parámetros para el índice de refracción medio para el aceite en 1.515 y la apertura numérica para el objetivo de aceite de 40x en 1.25. Coloque el orificio del detector en un área, unidad y elija una longitud de onda de excitación láser.
Utilice la restauración iterativa establecida en 100% de confianza, límite de iteración de 10 ciclos y las PSF verdes y rojas para la deconvolución de las señales de fluorescencia verde y roja. Utilice la herramienta Crear superficie para crear una superficie alrededor de las señales nerviosas desconvolucionadas, seleccionando la característica suave desactivada, la intensidad absoluta para el umbral, un umbral inferior de 3.000 y un umbral superior de 65.535. Mantenga las superficies por encima de los 10 vóxeles.
Elimine las superficies no nerviosas utilizando la pestaña Editar en la superficie nerviosa para seleccionar superficies no nerviosas individuales, o mantenga presionada la tecla Control para seleccionar varias superficies no nerviosas. Elimine las superficies no nerviosas seleccionadas presionando el botón Eliminar. Utilice la pestaña Editar en la superficie del nervio y presione el botón Enmascarar todo en las propiedades de la máscara.
En la nueva ventana, seleccione Canal 5 Mitocondrias desconvolucionadas en la selección de canal y luego verifique el canal duplicado antes de aplicar la máscara. Presione el botón de opción para un exterior interior constante y verifique los vóxeles establecidos en la superficie exterior a 0.0. Y presione el botón OK.
Por último, cree superficies específicas de mitocondrias con la herramienta Crear superficie para crear una superficie alrededor de las señales mitocondriales desconvolucionadas enmascaradas seleccionando la función Suavizar sin marcar y utilizando Resta de fondo para el umbral. Establezca el diámetro de la esfera más grande en 1,50 micrómetros, el umbral inferior en 2.000 y el umbral superior en un máximo de 65.535. Asegúrese de mantener las superficies por encima de 1.0 vóxeles.