Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 2:31 min. • May 29th, 2025
Comience con una cámara de imágenes que contenga un explante cerebral de Drosophila inmovilizado sumergido en un tampón para mantener la función celular.
Las neuronas en el cerebro expresan indicadores de calcio fluorescentes citoplasmáticos, que se unen a los iones de calcio y emiten fluorescencia.
Coloque la cámara de imágenes debajo de un microscopio de fluorescencia equipado con una lente de inmersión en agua.
Baje la lente y, bajo iluminación de campo claro, concéntrese en el cerebro.
Cambie al modo de fluorescencia y capture la imagen.
A continuación, introduzca un neuropéptido en el tampón e inicie la grabación de lapso de tiempo.
El neuropéptido se une a su receptor en las neuronas, desencadenando la señalización intracelular. Esto abre los canales de calcio y permite la entrada de iones de calcio.
Estos iones de calcio se unen a los indicadores y aumentan la intensidad de la fluorescencia.
Vuelva a capturar la imagen después de la estimulación con neuropéptidos.
Compare las imágenes antes y después de la estimulación con neuropéptidos.
Un aumento en la intensidad de la fluorescencia después de la estimulación con neuropéptidos refleja la respuesta del cerebro de Drosophila a la señalización de neuropéptidos.
Para adquirir imágenes de fluorescencia de calcio, coloque la cámara de imágenes que contiene el explante cerebral bajo el microscopio. Baje la lente del objetivo hasta que toque el PBS. Y bajo iluminación de campo claro, coloque el cerebro y enfríquelo.
Cambie a luz fluorescente y ajuste el enfoque en las celdas etiquetadas con GCaMP6. Inicie la adquisición a 250 milisegundos por fotograma con una resolución de 512 por 512 píxeles en modo refrigerado por agua. Luego, ajuste el tiempo de exposición para obtener los valores de fluorescencia dentro del rango dinámico de la cámara CCD, pero no inferior a 1,000 unidades arbitrarias con imágenes de 16 bits.
Una vez determinados los parámetros de imagen, tome las imágenes durante un minuto antes de la administración del péptido para detectar intensidades de señal de referencia. Posteriormente, aplique el péptido de prueba directamente pipeteando 100 microlitros de la solución peptídica preparada en el baño de larvas. Registre la emisión de GCaMP6 durante unos minutos.