JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociencia
0 vistas • 2:56 min • May 29th, 2025
Tome una sección sagital del cerebro de un ratón para exponer los ventrículos, que son cavidades llenas de líquido cefalorraquídeo o LCR.
Las células ependimarias que recubren los ventrículos poseen cilios móviles que impulsan el LCR para facilitar su circulación.
Coloque la sección en un plato con fondo de vidrio que contenga un medio rico en nutrientes para mantener la actividad ciliar.
Transfiera el plato a la cámara climatizada de un microscopio de contraste de interferencia diferencial, o DIC, para mantener la viabilidad celular durante la obtención de imágenes.
La microscopía DIC emplea un prisma para dividir la luz polarizada, dirigiéndola a través de la muestra a lo largo de diferentes caminos.
Las variaciones en el índice de refracción a través de la muestra introducen diferencias de fase entre los haces.
Un segundo prisma recombina los haces, creando interferencias que producen una imagen de alto contraste con un efecto tridimensional, mejorando la visibilidad de estructuras finas.
Localice las células ependimarias funcionales con cilios móviles observando el movimiento de las burbujas generado por su batido.
Usando imágenes DIC de alto contraste, registre los cilios para cuantificar su frecuencia de latido.
Para obtener imágenes de las secciones, coloque las rodajas de cerebro en placas de cultivo con fondo de vidrio de 30 milímetros que contengan 1 mililitro de medio con alto contenido de glucosa y ajuste el entorno de la cámara del microscopio cerrado a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono, utilizando una lente de inmersión en aceite objetivo de 60x.
A continuación, concéntrese en las células con luz transmitida DIC regular. Luego, siguiendo la dirección del movimiento de la burbuja DMEM, como guía para la ubicación de los cilios ependimarios móviles, use el filtro DIC para seleccionar un área que contenga células sanas con cilios móviles en el ventrículo lateral del cerebro. Al identificar los cilios ependimarios, ajuste la luz y enfoque para obtener una imagen satisfactoria.
A continuación, configure los parámetros de imágenes en vivo en el software de imágenes. Por ejemplo, aquí se adquieren imágenes de 24 bits, con el binning de la cámara configurado en 1 veces 1, combinado con el objetivo de 60x y un tiempo de exposición de 5 a 10 milisegundos.
Abra la apertura del microscopio al nivel óptimo para un tiempo de exposición mínimo y recopile las imágenes DIC. Observe el flujo de imágenes en vivo a la cámara para proporcionar una adquisición de imágenes rápida e inmediata sin demora. La velocidad de latido de los cilios se puede calcular en función del requisito de los tiempos de exposición mínimos para obtener un contraste de imagen suficiente.