Microscopía de dos fotones para obtener imágenes de la morfología neuronal en una cría de ratón

Comience configurando la luz de excitación para el microscopio de dos fotones.

Tomemos un cachorro de ratón transgénico anestesiado con una ventana circular de imágenes de vidrio y una placa para la cabeza implantada en su cráneo.

Las neuronas expresan proteínas fluorescentes rojas para facilitar la obtención de imágenes.

Limpie la ventana de imágenes de vidrio y asegure al cachorro en la etapa de imágenes de dos fotones.

Alinee la ventana de imágenes con el objetivo del microscopio ajustando la cabeza del cachorro.

Use una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal del cachorro.

Ajuste el caudal anestésico.

Aplique una gota de agua sobre el cubreobjetos y, a continuación, baje la lente del objetivo del microscopio.

La microscopía de dos fotones utiliza dos fotones de luz para activar proteínas fluorescentes, lo que permite obtener imágenes neuronales detalladas con un mínimo de ruido de fondo y fotoblanqueo.

Capture imágenes de las neuronas a varias profundidades para visualizar su estructura

Finalmente, apile las imágenes para generar una representación tridimensional de la neurona, incluidas sus proyecciones neuronales, para estudiar los cambios morfológicos relacionados con el crecimiento.

Para comenzar a obtener imágenes, primero configure la longitud de onda del láser de dos fotones. Para la excitación RFP, use una longitud de onda de 1,000 nanómetros. Limpie la superficie del cubreobjetos con etanol al 70%. Fije el cachorro anestesiado a la placa de titanio en la platina de imágenes con la barra de titanio. Utilice la platina del goniómetro para ajustar la cabeza de modo que el cubreobjetos quede paralelo a la lente del objetivo.

Mantenga la temperatura corporal del cachorro durante las imágenes, usando una almohadilla térmica a 37 grados Celsius, y reduzca la concentración de isoflurano a 0.7% a 1%. Coloque la platina de imágenes debajo de la lente del objetivo de 20X del microscopio de dos fotones. Aplique una gota de agua sobre el cubreobjetos.

Configure el software para adquirir imágenes de pila z a intervalos de 1,4 micras. Para las imágenes de neuronas de capa cuatro, establezca el ancho z entre 150 y 300 micras para obtener imágenes de toda la morfología dendrítica. Utilice el escaneo lento y el promedio para obtener imágenes claras que muestren la morfología neuronal.

Por lo general, se tarda más de 20 minutos en adquirir toda la morfología dendrítica.