Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 3:54 min. • May 29th, 2025
Asegure una Drosophila transgénica inmovilizada con la cabeza expuesta en una cámara de registro en una platina de microscopio de fluorescencia.
El cuerpo del hongo de la mosca comprende neuronas que expresan una proteína de fusión bioluminiscente sensible al calcio, que es activada por un cofactor precargado.
Conecte un tubo de perfusión a la cámara. Localice los cuerpos fluorescentes de los hongos, centrándose en el cáliz y los lóbulos mediales. Confirme el drenaje con tampón.
Establezca los parámetros de imagen y concéntrese en el cáliz y los lóbulos mediales. En la oscuridad, adquiera imágenes de fluorescencia de referencia de los cuerpos de los hongos antes de la exposición a estimulantes.
Perfunda la nicotina en un tampón que contiene calcio para activar los receptores nicotínicos de acetilcolina, lo que desencadena la entrada de calcio y la emisión de luz bioluminiscente.
Lavar con tampón para restaurar las condiciones basales.
Perfundir cloruro de potasio para despolarizar las neuronas, desencadenando la liberación de calcio intracelular y la emisión de señales bioluminiscentes.
Lavar con tampón para restaurar las condiciones basales.
Analizar imágenes para evaluar la actividad espacial y temporal del calcio en el cáliz y los lóbulos mediales.
- A continuación, coloque la muestra en el soporte bajo el microscopio y ajuste el aumento a 5x. Luego, inserte el tubo de perfusión en el canal a través de la punción. Ponga el microscopio en modo fluorescente, luego centre y enfoque los cuerpos de los hongos. Una vez que los cuerpos de los hongos estén enfocados, cambie el aumento a 20x. Vuelva a centrar la imagen y ajuste el enfoque.
A continuación, coloque el aparato de drenaje sobre la piscina de drenaje y ajuste la altura de la derivación de drenaje para que la punta quede justo por encima de la piscina de drenaje. Luego, enjuague la muestra con la solución de Ringer durante 30 segundos para verificar que el drenaje sea adecuado. Finalmente, baje el protector para sellar el aparato de cualquier luz exterior.
Usando el sistema automatizado en el programa Photon Imager, realice ajustes finos en el enfoque y tome una imagen fluorescente de referencia de los cuerpos de los hongos. Ajuste la posición de los cuadros de la región de interés sobre el cáliz, los cuerpos celulares y los lóbulos mediales haciendo clic en los cuadros y arrastrándolos a su posición mientras mantiene presionada la tecla Control.
Ahora, registre los valores de referencia durante aproximadamente 5 a 10 minutos. A continuación, encienda el interruptor para comenzar el flujo de nicotina. Al mismo tiempo, presione Entrar y agregue una nota para indicar que el flujo de nicotina ha comenzado. Después de un minuto, detenga el flujo y haga otra nota en el registro que indique que el flujo se ha detenido. Luego, lave la muestra con la solución de Ringer durante cinco minutos.
Mientras la muestra se recupera, apague el lavado, configure el temporizador durante cinco minutos adicionales y prepárese para iniciar el flujo de cloruro de potasio. Cuando esté listo para comenzar, inicie el flujo de cloruro de potasio e ingrese 100 milimolares de cloruro de potasio en el registro de muestras. Después de un minuto, detenga el flujo e ingrese cloruro de potasio apagado en el registro de muestras. Luego, lave la muestra con la solución de Ringer durante un minuto y cambie el microscopio al modo fluorescente. Tome una imagen fluorescente final y luego apague la solución de Ringer y retire la muestra.