Ablación neuronal dirigida mediante microscopía de dos fotones en un pez cebra Larava

Comience con una larva de pez cebra transgénica anestesiada inmovilizada en agarosa y colocada en una placa de Petri que contenga una solución anestésica.

Colóquelo bajo un microscopio láser de dos fotones, que utiliza dos fotones para obtener imágenes detalladas.

Concéntrese en las capas superior e inferior del cerebro para establecer límites de imágenes.

Capture imágenes a varias profundidades para observar las neuronas antes del tratamiento con láser.

Ajuste el enfoque en la región de interés y ajuste el tamaño del marco para refinar el enfoque en las neuronas.

Seleccione e irradie las neuronas utilizando el láser de dos fotones.

El láser induce calor localizado, lo que resulta en la muerte neuronal con un daño mínimo al tejido circundante. Captura la imagen.

Compare las imágenes previas y posteriores al tratamiento para evaluar los cambios de fluorescencia.

Reenfocar las neuronas en planos más profundos y repetir la irradiación para tratar todas las neuronas en la región de interés.

Vuelva a capturar la imagen y compárela con la imagen de pretratamiento. La pérdida de fluorescencia después del tratamiento con láser confirma el éxito de la ablación neuronal.

Coloque la larva incrustada en agarosa bajo un microscopio de escaneo láser de 2 fotones y ponga en marcha el sistema de microscopía. Abra el software de adquisición de imágenes y, en la pestaña Láser, haga clic en el botón de encendido para encender el láser. Espere a que el estado del láser cambie de Ocupado a Modo bloqueado.

En la pestaña Canales, establezca la longitud de onda del láser en 880 nanómetros para la ablación EGFP o 800 nanómetros para la ablación GcAMP. Seleccione la lente del objetivo de 20x moviendo manualmente el revólver de lente. A continuación, haga clic en la pestaña Localizar. Haga clic en GFP para cambiar las vías ópticas y ver directamente la fluorescencia a simple vista. Centre el cerebro larvario del pez cebra en el campo de visión. Luego, haga clic en la pestaña Adquisición para volver a la microscopía de dos fotones y establecer la potencia y la ganancia del láser.

Como registro de la condición anterior a la ablación, haga clic en Z-Stack para seleccionar la opción Z-Stack. Luego, después de enfocarse en el extremo ventral del cerebro larvario, haga clic en el botón Establecer primero para establecer el límite inferior. Y después de enfocarse en la superficie más dorsal del cerebro, haga clic en el botón Establecer último para establecer el límite superior. Por último, haga clic en el botón Iniciar experimento para ejecutar la adquisición de imágenes Z-Stack.

A continuación, seleccione la lente del objetivo de 63x moviendo manualmente el revólver de lente. A continuación, haga clic en la pestaña Localizar para cambiar a microscopía de epifluorescencia. Centrar las células que se van a ablacionar a simple vista. Luego, haga clic en la pestaña Adquisición para volver a la microscopía de escaneo láser.

En la pestaña Modo de adquisición, establezca el tamaño del fotograma en 256 por 256. Haga clic en Vivir y observe las neuronas de interés. Luego, comenzando desde el lado más dorsal, encuentre un plano focal en el que las células que se van a ablacionar estén enfocadas. Usando la función Regiones, marque un área circular pequeña de aproximadamente un tercio del tamaño de la célula en diámetro en cada neurona como ROI.

Establezca la velocidad de escaneo en 13,93 segundos por 256 por 256 píxeles, lo que corresponde a un tiempo de permanencia del láser de aproximadamente 200 microsegundos por píxel, o 200 microsegundos por media micra. Además, establezca el ciclo de iteración en 4 repeticiones. Haga clic en Iniciar experimento para ejecutar las funciones de serie temporal y decoloración. Compare la imagen antes de la ablación con la imagen después de la ablación en el ciclo de serie temporal, para asegurarse de que la fluorescencia en las células objetivo haya desaparecido.

A continuación, mueva el plano focal un poco más profundo y elija el siguiente plano focal donde aparecen las celdas sin blabla. Lleve a cabo la función de blanqueamiento como se acaba de demostrar y repita el proceso hasta que se hayan ablacionado todas las células de la estructura neural de interés. Después de la ablación, verifique que las células no tengan fluorescencia abolida y repita la irradiación con láser si es necesario.