Imágenes de fluorescencia de la agregación de proteínas PolyQ en neuronas de Caenorhabditis elegans

Comience con gusanos Caenorhabditis elegans anestesiados, de la misma edad y deficientes en chaperonas.

Ambos grupos expresan proteínas poliQ marcadas con fluoróforos en sus neuronas que son propensas a plegarse incorrectamente.

En los gusanos de control, las proteínas chaperonas limitan la agregación de poliQ mal plegada, mientras que, en los gusanos deficientes en chaperonas, el poliQ mal plegado forma fácilmente agregados.

Coloque el portaobjetos de control en una platina de microscopio confocal para microscopía de imágenes de fluorescencia (FLIM).

Ilumine los gusanos con un láser pulsado.

El láser excita el fluoróforo, que emite un fotón a medida que regresa al estado fundamental.

FLIM mide la vida útil de la fluorescencia, la duración que el fluoróforo permanece en su estado excitado.

En los gusanos deficientes en chaperonas, la agregación polyQ agrupa fluoróforos, promoviendo la transferencia de energía entre fluoróforos adyacentes en lugar de la emisión de fotones, lo que reduce la vida útil de la fluorescencia.

El software FLIM procesa estas vidas para generar mapas codificados por colores, lo que permite la visualización de la agregación.

Una vida útil de fluorescencia reducida en gusanos deficientes en chaperonas, en comparación con los controles, indica una mayor agregación de poliQ.

Asegúrese de que los nematodos estén completamente inmóviles. Abra el software de adquisición FLIM. Localice el botón Tab y presione Habilitar salidas. Coloque el portaobjetos con los C. elegans montados en el escenario y, utilizando una lente de aumento de 10 veces en modo de transmisión, localice la posición de los nematodos en el portaobjetos. Retire la diapositiva, cambie el objetivo a una lente de aumento de 63 veces y aplique el medio de inmersión requerido.

Coloque el portaobjetos en el escenario y localice los nematodos. Comience a escanear la muestra. Seleccione una región de interés y concéntrese en su plano de proyección máximo. En la interfaz del software FLIM, obtenga una vista previa del número de fotones detectados. El valor de ADC debe estar entre 1 por 10 hasta el cuarto y 1 por 10 hasta el quinto. Si es necesario, cambie el enfoque a un plano diferente o aumente la potencia del láser para recolectar más fotones.

- Asegúrese de evitar la acumulación de fotones, pero recolecte una cantidad suficiente de fotones para crear un buen ajuste y medición de por vida.

- En la barra de menús, seleccione la pestaña para establecer los parámetros de adquisición. Seleccione Scan Sync In para permitir la detección de un solo fotón. Establezca la adquisición en una cantidad fija de tiempo o un número fijo de fotones. Presione Iniciar para comenzar la adquisición. Abra el software e importe archivos de datos FLIM a través de Archivo, Cargar datos FLIM. Cargue todas las muestras de una condición, incluso si se obtuvieron en diferentes sesiones y de diferentes repeticiones biológicas.

Si es necesario, segmente un solo nematodo para muchas imágenes FLIM a través de Segmentación, Administrador de segmentación. Arrastre la herramienta de recorte alrededor del área de interés hasta que se resalte. Una vez completado, presione OK. Seleccione una pequeña región donde aparezca la imagen basada en la intensidad de un C. elegans. La curva de decaimiento de esa región aparece en la ventana de decaimiento grande en el lado derecho de la interfaz.

Para extrapolar la duración en la pestaña Datos, establezca un valor mínimo integrado arbitrario entre 40 y 300 para excluir los píxeles que sean demasiado tenues para producir un buen ajuste. Seleccione un número de tiempo mínimo y un número de tiempo máximo para limitar la señal FLIM a estos valores. No cambie el preajuste cuenta el fotón de uno. Ingrese la tasa de repetición en megahercios del láser utilizado durante la adquisición.

Introduzca un valor máximo de puerta para excluir todos los píxeles saturados. En la pestaña Duración, seleccione un accesorio global que se utilizará. No cambie ningún otro parámetro excepto el número de selección exponencial si se sabe que la decaimiento de fluorescencia elegida es multiexponencial y exhibe más de una vida útil.

Cargue el IRF a través del menú IRF. Para estimar el desplazamiento IRF, seleccione IRF, Estimación, Desplazamiento IRF. Aparece automáticamente un conjunto de valores en la pestaña IRF. Una vez establecido esto, no cambie ningún otro parámetro de esta pestaña. Una vez configurados todos los parámetros, presione Ajustar conjunto de datos. El ajuste resultante resaltado en una línea azul debe superponerse con todos los eventos. Se obtiene un buen ajuste cuando todos los eventos están alineados a lo largo del ajuste.

Haga clic en la pestaña Parámetros ubicada en los menús superiores derechos de la interfaz del software y seleccione estadística, media ponderada y verifique que el valor de chi-cuadrado sea lo más cercano posible a uno. El valor de vida útil de la imagen seleccionada se revela como tau 1. Exporte cualquier información de interés a través de Archivo, Exportar imágenes de intensidad, Ajustar tabla de resultados, Imágenes, Histogramas.