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Comience con una rebanada cerebelosa obtenida de un cerebro de cachorro de rata postnatal en una placa de múltiples pocillos que contenga medios.
Retire el medio e incube la rebanada en una solución de colorante fluorescente citoplasmático para marcar las células granulares (GC).
Transfiera la rebanada a una membrana de inserto de transpozo y elimine el exceso de tinte.
Retire el inserto y llene el pocillo con medios. Luego, vuelva a colocar el inserto y agregue medios para cubrir el tejido.
Incube para permitir que el tejido se adhiera a la membrana del inserto.
Transfiera la placa a una incubadora conectada a un macroscopio confocal y coloque una cubierta de vidrio sobre la placa.
Establezca las condiciones de cultivo, incube aún más el tejido y luego comience a obtener imágenes.
Tras la iluminación láser, los GC etiquetados son fluorescentes.
Capture imágenes de lapso de tiempo para visualizar la migración radial de los GC a través de la capa molecular del cerebelo.
Utilizando un software de imágenes, analice la distancia migratoria de los GC.
Después de cortar la muestra, use una pipeta de bulbo blanco truncado para transferirla con un poco de HBSS a una placa de seis pocillos. Cargue hasta tres rebanadas en cada pocillo. A continuación, después de vaciar el medio en cada pocillo cargado, agregue cinco mililitros de solución de carga que contenga 10 micromolares del tinte fluorescente. Para proteger las muestras de la luz, cubra la placa con papel de aluminio. Luego coloque la placa en un mutador a 35 RPM. Deje que la placa incube durante 10 minutos a temperatura ambiente para que el tinte marque las células.
Ahora, transfiera las rodajas como antes a la membrana de un inserto transwell que tenga poros de tres micras. Luego aspire el medio de carga, dejando solo las rodajas. Ahora, retire el inserto y las rodajas para llenar el pocillo con 1,9 mililitros de DMEM. Luego vuelva a colocar el inserto y agregue otros 100 microlitros de DMEM para cubrir los tejidos.
Incube esta preparación durante dos horas, después de lo cual las células granulares serán visibles. Transfiera la placa sin tapa a una cámara ambiental con flujo de gas constante en un macroscopio confocal. Luego, coloque una cubierta de vidrio en el inserto de la placa del macroscopio confocal. Para experimentos de lapso de tiempo, deje que las células se incuben en la cámara durante dos horas adicionales antes de continuar.
Para visualizar las células granulares que migran en las rodajas de tejido, ilumine la preparación con luz de 488 nanómetros y use un objetivo seco 2X. Detecte emisiones de fluorescencia de 500 a 530 nanómetros. Con ImageJ, para cada imagen de la película de lapso de tiempo, realice una proyección de pila Z utilizando el modo de desviación estándar.
Ajuste los niveles de contraste y brillo de cada imagen para que las celdas granulares etiquetadas sean fáciles de ver. Ahora, elija el complemento Seguimiento manual en el menú de análisis de partículas. Utilice el complemento para hacer clic en el punto central de cada cuerpo de celda etiquetado a lo largo de la secuencia de imágenes de lapso de tiempo. A continuación, exporte los datos de seguimiento sin procesar a una hoja de cálculo para su posterior análisis.
Reorganice los datos de seguimiento sin procesar exportados de ImageJ con una herramienta inteligente hecha en casa que identifica cada celda y las posiciones asociadas. Usando el programa, calcule la distancia total recorrida y la velocidad promedio de migración para cada celda.