JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociencia
0 vistas • 3:06 min • June 17th, 2025
Comience con larvas de pez cebra transgénicas anestesiadas en una cámara de montaje que contenga un tampón fisiológico oxigenado bajo un microscopio estereoscópico.
El cerebelo en el cerebro contiene neuronas de Purkinje modificadas genéticamente que expresan proteínas citoplasmáticas fluorescentes.
Retire el exceso de medio, luego agregue agarosa fundida para inmovilizar las larvas para obtener imágenes estables.
Oriente las larvas dorsal hacia arriba para visualizar el cerebelo.
Una vez solidificado, recorte el exceso de agarosa. Con una aguja de vidrio, extirpe la piel pigmentada que recubre el cerebro para exponerla.
Voltee el bloque de agarosa en una cámara de imágenes que contenga agarosa fundida para obtener imágenes bajo un microscopio invertido.
Agregue el tampón fisiológico para preservar la función neuronal.
Coloque la cámara debajo de un microscopio confocal invertido. Aplique luz de excitación para excitar las proteínas fluorescentes, lo que permite la visualización de las neuronas marcadas.
Las células pigmentadas de la piel, si no se eliminan, dispersan y absorben la luz de excitación, reduciendo la intensidad de la fluorescencia.
La eliminación de la piel mejora la penetración de la luz para mejorar la intensidad de la fluorescencia, facilitando la visualización de las neuronas.
Para incrustar la larva, use una pipeta Pasteur para transferir la larva anestesiada a una cámara de montaje bajo un microscopio estereoscópico. Si alguna larva aún puede moverse, no use el pez para el experimento hasta que el pez sea completamente incapaz de moverse. Cuando la larva esté inmóvil, retire con cuidado el exceso de medio e inmediatamente agregue al menos 1 mililitro de agarosa de bajo derretimiento sobre la larva.
Oriente el pez cebra con la región dorsal hacia arriba lo más cerca posible de la superficie de la agarosa. Si las larvas se visualizarán con un microscopio invertido, después de solidificarlas, recorte la agarosa que contiene la larva en un pequeño bloque cuboide. Para exponer el cerebro para obtener imágenes, recorte el exceso de agarosa sobre la región del cerebro de interés según sea necesario y use una aguja de vidrio para hacer una pequeña incisión a través de la piel cerca pero no sobre la región de interés, sin penetrar demasiado profundamente en el tejido.
Apenas moviendo la aguja justo debajo de la superficie de la piel, continúe haciendo cortes muy pequeños con cuidado alrededor de la región de interés hasta que la piel sobre la región de interés pueda eliminarse o apartarse. Cuando se haya extraído el tejido de todos los embriones, agregue una pequeña gota de agarosa de bajo punto de fusión a una cámara de imágenes previamente preparada de un microscopio invertido y use una espátula pequeña para voltear el bloque de agarosa cuboide 180 grados sobre la gota de agarosa en la cámara de imágenes. Cuando la agarosa se haya solidificado, llene la cámara de imágenes con ACSF fresco y comience a obtener imágenes de la larva.