Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 6:52 min. • June 17th, 2025
Coloque una muestra de tejido cerebral de ratón y estándares en una cámara de ablación con láser.
Los estándares contienen concentraciones conocidas de metales enriquecidos en homogeneizados de tejido cerebral de cordero.
Llene la cámara con gas argón y enfoque un rayo láser ultravioleta en el tejido.
El láser vaporiza la muestra y los patrones en un patrón lineal, creando un aerosol de partículas finas.
El gas argón transporta las partículas al plasma acoplado inductivamente, una fuente de ionización de alta temperatura.
El plasma atomiza e ioniza las partículas en iones cargados positivamente.
Los iones ingresan al espectrómetro de masas y se separan en función de sus relaciones masa-carga.
Los datos resultantes se comparan con una base de datos de referencia para identificar los metales presentes en la muestra. A partir de los estándares, se genera una curva de calibración.
Calcule las concentraciones de metales en la muestra calibrando sus intensidades de señal con las de los estándares, revelando la distribución espacial de los metales dentro del corte cerebral.
Primero, coloque una muestra de tejido cerebral y todos los estándares de tejido compatibles con la matriz en la cámara de ablación láser. Asegúrese de que las muestras estén dentro de la profundidad de campo de la cámara LACCD. Cierre la puerta de la cámara y apriete los tornillos con los dedos.
Luego, en el software ICP-MS, abra la válvula de gas portador y configure el caudal en 1,2 litros por minuto. En el software LA, ejecute una purga de 30 minutos de la celda de ablación con el gas portador para una celda de ablación de 2 volúmenes. Cada 10 minutos, mueva la platina de muestra a cada esquina de la cámara para reducir la cantidad de aire residual en la celda.
Encienda el ICP-MS y deje que el instrumento se caliente durante dos horas. Mientras el instrumento se calienta, en el software de ablación láser, dibuje una línea de ablación de aproximadamente 3 milímetros de largo a través de la superficie del primer estándar de tejido. Haga clic en la línea de ablación y establezca el diámetro del haz predeterminado, la velocidad de escaneo y la fluencia radiante. Duplique la línea seis veces, separando las líneas por el diámetro de la viga. Repita este proceso para cada estándar.
Luego, use la herramienta Línea para dibujar el área de ablación sobre la muestra desde la esquina superior izquierda a través del punto más ancho de la muestra, utilizando los mismos parámetros que para los estándares.
Duplique la línea según sea necesario para una cobertura completa de la muestra con el mismo espaciado que se usa en los estándares. Luego, dibuje un conjunto de líneas para el escaneo intermitente de estándares a más tardar después de 20 horas de escanear la muestra o entre cada muestra. Agregue un escaneo de los estándares al final del experimento.
En función de la longitud de la línea y la velocidad de escaneo, determine el tiempo de análisis de la muestra y las líneas estándar. A continuación, cree un nuevo lote en el software ICP-MS y seleccione Análisis de tiempo resuelto. Elija los valores de relación masa-carga de interés y establezca los tiempos de integración para cada relación, de modo que el tiempo total de integración para un ciclo sea de 0,25 segundos. Guarde el lote.
Para un lote estándar, complete el tiempo de análisis de cada línea con un búfer adicional de 15 segundos para tener en cuenta los tiempos de calentamiento y lavado del láser. Fije una lista de ejecución de ejemplo con una adquisición para cada línea estándar. Para el lote de muestras, duplique el lote estándar y ajuste los tiempos y el número de adquisiciones en consecuencia para el patrón de ablación de muestras.
Una vez que el ICP-MS se haya calentado, agregue el primer lote a la cola y asegúrese de que el software esté esperando un disparo del instrumento LA. Luego, en el software LA, encienda la fuente de alimentación del láser y configure los tiempos de calentamiento y lavado del láser. Inicie la secuencia del láser y verifique que la ICP-MS inicie correctamente la recopilación de datos después de la ablación.
Una vez recopilados los datos, extraiga los datos de los estándares de los archivos CSV. Realice la resta de línea base y excluya la señal de fondo. Identifique las caídas de señal causadas por agujeros en los estándares de tejido.
Enmascare estas áreas de baja señal y luego exporte los datos como una hoja de cálculo. Calcule un factor de conversión de CPS a PPM para cada elemento identificado. Repita este proceso para cada estándar.
A continuación, abra el software de construcción de imágenes cuantitativas e importe los datos de muestra de los archivos CSV. Seleccione varias áreas del fondo para aplicar la corrección de fondo. Seleccione la herramienta de edición de gráficos, haga clic con el botón derecho en la imagen y seleccione Modificar apariencia de imagen. Cambie el primer color en Z a un valor negativo grande.
Y haga clic en Listo para mejorar la señal de fondo. A continuación, en la pestaña Normas, introduzca los factores de corrección de PPM de CPS para cada norma y haga clic en Ir. Abra el Explorador de datos en la pestaña Datos, haga clic con el botón derecho en un archivo de imagen corregido y haga clic en Nueva imagen.
Abra la ventana Modificar apariencia de imagen y establezca la tabla de colores y la escala. Utilice la utilidad Agregar anotación para colocar una escala de color en la imagen. Ajuste la escala de colores en la ventana de escala de colores. Una vez que la imagen haya sido coloreada y anotada, copie y pegue la imagen en otro programa o exporte la imagen desde el software de construcción de imágenes.
Para activar las herramientas de ROI, seleccione Procesamiento de imágenes en los paquetes de análisis y elija una imagen. En la pestaña Imagen, haga clic en ROI e inicie ROI Draw. Seleccione la región de interés y, a continuación, haga clic en Finalizar ROI.
En la pestaña Imagen, haga clic en Estadísticas para obtener los datos de ROI. Copie y pegue los datos en una hoja de cálculo, asegurándose de guardar cuando se agregue cada ROI. Repita el proceso según sea necesario.