JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociencia
0 vistas • 3:15 min • June 17th, 2025
Comience con un explante de retina de ratón posnatal vivo montado en un filtro de membrana y colocado en una cámara de incubación bajo un microscopio confocal.
La retina se transfecta para expresar una proteína fluorescente en las membranas de las interneuronas amacrinas con brotes estelares.
Coloque un peso de muestra prehumedecido sobre la retina para estabilizarla.
Llene la cámara con tampón.
Mantenga el flujo y la temperatura óptimos del amortiguador en la cámara para preservar la viabilidad neuronal.
Coloque un objetivo de inmersión en agua en la cámara de imágenes.
Comience las imágenes de epifluorescencia.
La luz láser, dirigida a través del objetivo, excita la proteína fluorescente en las células amacrinas.
La fluorescencia emitida se captura a través del mismo objetivo, lo que permite la visualización de las células amacrinas marcadas.
Identifique una célula brillantemente fluorescente para obtener imágenes.
Establezca los parámetros de imagen.
Capture imágenes en múltiples planos Z para lograr una visualización 3D de la morfología dendrítica completa.
Realice imágenes de lapso de tiempo para rastrear los cambios en la morfología dendrítica a lo largo del tiempo.
Ensamble la cámara de incubación de imágenes en vivo y llénela con aCSF oxigenado. Encienda la bomba y el controlador de temperatura, asegurándose de que la temperatura no supere los 34 grados centígrados. La temperatura de la cámara puede tardar hasta una hora en estabilizarse. Se recomienda configurar la cámara de incubación antes de comenzar la disección de la retina. La temperatura estable de la cámara ayuda a reducir la deriva de la muestra.
Para transferir el montículo plano de la retina a la cámara de perfusión, detenga la bomba y retire el líquido cefalorraquídeo que se encuentra en la cámara. Luego, coloque el disco MCE con la montura plana de la retina en la cámara de incubación. Humedezca previamente un peso de muestra para romper la tensión superficial, luego colóquelo en el montículo plano, asegurándose de que el peso de la muestra se coloque en el papel MCE para reducir la deriva de la muestra. Vuelva a llenar la cámara con el aCSF calentado y haga circular aCSF a aproximadamente 1 mililitro por minuto.
Coloque la pieza nasal con el objetivo de inmersión de agua 25 veces en la cámara de imágenes. Detecte las células marcadas de interés utilizando luz epifluorescente y ajuste el volumen de imágenes para capturar las características dendríticas de interés.
Usando una tabla de búsqueda que identifique píxeles sobresaturados y subsaturados, ajuste la potencia del láser para que no haya píxeles sobresaturados. Adquiera el volumen de imágenes 3D y repita la adquisición a la velocidad de fotogramas deseada. El volumen de imágenes se puede ajustar entre cada punto de tiempo para compensar la deriva de la muestra.