La concentración de los metabolitos de las comunidades planctónicas de baja densidad para la metabolómica ambiental utilizando espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear

La espectroscopía de resonancia magnética nuclear ofrece varias ventajas distintivas para la investigación de metabolómica ambiental, pero es relativamente insensible en este procedimiento. Se describe un método de filtración para la concentración y extracción de metabolitos de comunidades completas a partir de sistemas acuáticos adecuados para RMN. Esto se logra primero mediante la preparación especial de filtros para la recolección de muestras, eliminando sustancias extraíbles.

El segundo paso del procedimiento consiste en filtrar la muestra, ya sea natural o experimental, sobre los filtros. El tercer paso del procedimiento es liofilizar el material de la muestra y extraer los metabolitos. El paso final del procedimiento es analizar las muestras mediante espectroscopía de resonancia magnética nuclear e integrar los datos según corresponda.

Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran cambios metabólicos en muestras naturales a lo largo de gradientes ambientales o en respuesta a manipulaciones experimentales mediante enfoques de metabolómica y transaminasas. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la centrifugación, es que se puede muestrear toda la comunidad y son posibles volúmenes de muestra más grandes para muestras de baja densidad. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de metales mixtos ambientales, como cómo los microorganismos responden a cambios ambientales. La demostración del procedimiento estará a cargo de Stage y de mi laboratorio.

Inicie este Protocolo colocando filtros en un vaso de precipitados limpio de 500 mililitros de Pyrex utilizando pinzas. Cubra el filtro con agua destilada para preenjuagar, agite bien para evitar que los filtros se adhieran entre sí. Vierta el agua y repita el enjuague dos veces.

Después del último enjuague, agregue 300 mililitros de agua Milli Q al vaso de precipitados y esterilice los filtros en autoclave. Una vez que los filtros hayan sido esterilizados en autoclave, vierta el agua Milli Q y enjuague los filtros tres veces como antes, pero utilizando agua Milli Q.

Coloque los filtros individuales sobre una superficie limpia y seca, como papel de aluminio, con pinzas, y séquelos a una temperatura razonable. Por ejemplo, a 37 grados o al aire, los filtros ya están listos para usar en la demostración de este protocolo. Se utiliza un manifold de filtración de acero inoxidable Millipore de tres posiciones equipado con columnas de filtro de microanálisis de 25 milímetros con soportes de vidrio y una bomba mecánica, empleando técnica aséptica.

Coloque un solo filtro de 25 milímetros sobre la base de la columna de filtración. Coloque la columna y sujete el aparato firmemente. Añada 15 mililitros de muestra obtenida previamente de un microcosmos con alto contenido de nutrientes a la columna.

Abra la válvula de cierre del manifold de filtración y encienda la bomba de filtración con presión suave para minimizar la ruptura celular. Para muestras de menor densidad, pueden ser necesarias adiciones sucesivas de agua. Tenga cuidado de no dejar que el filtro se seque durante un período prolongado entre las adiciones de agua.

Dos, reduzca las sales paramagnéticas residuales de las muestras marinas y, opcionalmente, realice un enjuague con agua dulce. Una vez finalizada la filtración, apague la bomba y deje la válvula abierta para que aún haya presión negativa bajo el filtro. Retire la pinza y la columna de filtración con una mano.

Utilice pinzas limpias para sostener el filtro. Doble el filtro sobre sí mismo pero no lo pliegue con la otra mano. Utilice el borde de un tubo estéril de microcentrífuga de dos mililitros para mantener el filtro presionado.

Coloque el filtro en el tubo de dos mililitros y suéltelo de manera que se abra con el lado de la muestra hacia adentro. Congele inmediatamente en nitrógeno líquido para extraer los metabolitos solubles en agua. Primero, liofilice las muestras durante la noche o al menos 10 horas; después de la liofilización, agregue un triturador de acero inoxidable a cada tubo.

Añada 750 microlitros de tampón estandarizado de fosfato de potasio y óxido de deuterio con estándar de DSS. Somete las muestras a sonicación durante cinco minutos a cuatro grados en un baño ultrasónico para eliminar el material celular del filtro. Retire los filtros con pinzas limpias.

Rompa las células utilizando un molino triturador a 1600 rpm durante cinco minutos. A continuación, incube a 65 grados Celsius. Agite en un agitador de banco durante 15 minutos.

Tras la incubación, retire el triturador metálico con pinzas limpias. Centrifugue la muestra a 13.000 G durante cinco minutos. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y transfiéralo directamente a un tubo de RMN para espectroscopia de RMN.

Cargue la muestra en el espectrómetro de RMN aquí. Las muestras se analizan en un espectrómetro Bruker DRX 500 equipado con una sonda TXI con gradiente de triple eje, operando a 298 Kelvin. Bloquee, sintonice y ajuste el imán.

Obtenga espectros de RMN de protones en 1D utilizando la interfaz TopSpin y métodos descritos previamente, o utilice otro software de interfaz de espectrómetro según sea necesario. Aquí, los espectros se adquirieron con supresión de las señales residuales del agua mediante la secuencia de pulsos Watergate con un tiempo de repetición de 1,2 segundos. En el presente ejemplo, se recolectaron 128 transitorios para cada muestra.

Transfiera los directorios de datos de RMN a una computadora personal con el software NMR pipe instalado. Procese los datos brutos, establezca la señal de DSS como referencia de cero PPM y luego fase manualmente los espectros. Digitalice los datos espectrales mediante bines aquí utilizando el paquete FT two B de acceso público del sitio web de comercio electrónico.

Otras utilidades de software como RNMR o Atomics también pueden utilizarse para bin.Bin. Los datos pueden normalizarse respecto a la señal total o a la señal de DSS para mostrar cambios proporcionales en la señal entre muestras. Los datos de salida ahora pueden utilizarse para análisis estadísticos posteriores, como el análisis de componentes principales o PCA, utilizando paquetes de software gratuitos como R, tal como se muestra.

A continuación se muestra un ejemplo de espectros de RMN de protones obtenidos mediante el procedimiento demostrado. Los espectros corresponden a dos puntos temporales de un experimento de microcosmos y muestran diferencias evidentes debidas a las actividades metabólicas de las algas. El espectro del día cuatro muestra una abundancia considerable de picos, particularmente en el rango de tres a 4:00 p.m., en comparación con la muestra del día uno.

Estos picos pueden atribuirse a los azúcares producidos por diatomeas en floración dentro del microcosmos. En un experimento similar, se utilizó un gráfico de puntuaciones de ACP derivado de la curvatura de Mr.Spectra, que muestra los dos primeros componentes principales, para comparar el crecimiento de comunidades naturales de plancton en agua de mar artificial y natural. Este enfoque estadístico reduce los datos multidimensionales a un formato más simple, en este caso bidimensional, y revela de manera sencilla la estructura en los puntos de datos subyacentes cercanos.

Aquí cada eje o ambos son más similares. Se pueden observar diferencias metabólicas claras entre los dos tratamientos. Los datos de este experimento se utilizaron para realizar un análisis multi-ómico.

La combinación de datos genómicos con RMN y la composición de la comunidad basada en la electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante de los genes 18S y 16S de ARNr también muestra patrones microbianos distintos entre microcosmos de agua de mar natural y artificial. Tal correspondencia entre metaboloma y genoma en sistemas naturales demuestra la utilidad de este enfoque. Al intentar este procedimiento, es importante recordar utilizar una técnica adecuada para minimizar la contaminación al seguir este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos, como el análisis de creación con niveles ómicos, para responder preguntas adicionales, como cómo el microbioma se correlaciona con ciertos metabolitos.