Inhibición de la actividad neuronal y su detección mediante electrofisiología en una rata

Comience con una rata anestesiada asegurada en un marco estereotáxico con el cráneo expuesto.

Usando los puntos de referencia anatómicos, el bregma y la lambda, localice el colículo superior, una estructura cerebral profunda responsable de procesar la información visual.

Perfora para crear un colgajo óseo, retíralo y aplica un tampón para mantener hidratado el cerebro expuesto.

Coloque un conjunto de inyectores que consiste en una micropipeta con un electrodo conectado a una microjeringa.

La micropipeta contiene una solución de neurotransmisor inhibidor para suprimir la excitabilidad neuronal mientras el electrodo registra simultáneamente la actividad neuronal.

Baje el inyectrode en el colículo superior y cubra la superficie expuesta con agar fundido para evitar la deshidratación.

La luz presente parpadea en el ojo para estimular las neuronas y evocar potenciales de acción sincronizados.

Inyectar el neurotransmisor, que se une a sus receptores y desencadena la afluencia de iones cloruro.

Esta afluencia hiperpolariza el potencial de membrana, suprimiendo así los potenciales de acción.

A medida que la concentración de neurotransmisores disminuye con el tiempo, la actividad neuronal se recupera.

Para preparar las pipetas de inyección de registro, primero, tire de un capilar de 7 centímetros con un diámetro exterior de 1 milímetro. Para un modelo vertical COP 720 o una unidad similar, ajuste el calentador a 18 y el solenoide a uno. A continuación, con guantes, rompa manualmente la punta para hacer una abertura y verifique bajo un microscopio que el diámetro interior esté entre 30 y 40 micrómetros. Mida esto con la regla del visor. Producirá una impedancia relativamente baja de 0,3 a 0,6 megaohmios.

Luego, desde el extremo no cónico, inserte un alambre plateado en la pipeta de unos 7 centímetros de largo y deje de 1 a 2 centímetros colgando de la pipeta. Doble este exceso de alambre ortogonalmente al capilar. A continuación, tome una aguja hipodérmica de calibre 30 y aplique adhesivo plástico flexible en el eje. A continuación, inserte lentamente la aguja en la pipeta en la medida de lo posible.

Agregue más adhesivo para crear un sello en la unión entre la pipeta y la aguja. Con la punta de la pipeta hacia arriba, deje que el conjunto se seque durante unas 12 horas. Después de anestesiar y colocar a la rata en un marco estereotáxico, aplique ungüento oftálmico, afeite su cabeza limpia.

Después de aplicar un anestésico local y confirmar un plan quirúrgico de anestesia, proceda a hacer una incisión en el cuero cabelludo a lo largo de la mediana con una hoja de bisturí número 10. Esto expondrá las suturas coronales y sagitales. Luego, usando una espátula quirúrgica, identifique las referencias anatómicas lambda y bregma.

Ajuste la posición de la cabeza para que estos puntos de referencia estén nivelados en el mismo plano horizontal. Luego ponga a cero un puntero rígido fino como un tubo de vidrio en el bregma. A continuación, ajuste la posición del tubo a una ubicación de interés utilizando las coordenadas del bregma.

Use un rotulador para dibujar un cuadrado alrededor del área objetivo de la craneotomía. Ahora, con el taladro quirúrgico esterilizado, retire lentamente el hueso a lo largo de las marcas. Comience usando la menor presión posible y mantenga el taladro en movimiento para evitar daños tisulares inducidos por la cabeza debido a la fricción.

Cuando el hueso se haya vuelto delgado, retire con cuidado la sección cuadrada con unas pinzas. No es necesario quitar la duramadre, ya que la varilla de inyección la penetrará. En el futuro, mantenga la corteza expuesta irrigada con líquido cefalorraquídeo. Prepare el inyector llenando primero una jeringa de 5 a 10 microlitros con aceite mineral. A continuación, prepare el medicamento de interés con un tinte en solución salina fisiológica. Aquí, el 0,5% de Chicago Sky Blue se mezcla con 300 GABA micromolares.

Ahora, llene la pipeta de inyección cargando primero una jeringa de 1 mililitro con la solución preparada y luego usando la jeringa para cargar la pipeta. Al retirar la jeringa, mantenga una ligera presión sobre el émbolo, para que el vacío no elimine la solución del inyector. Verifique si hay fugas de líquido en posibles puntos de fuga. Limpie el exceso de líquido y vuelva a verificar si hay fugas.

Ahora conecte la microjeringa con aceite mineral a la inyectora. Luego limpie cualquier exceso de solución con una gasa. Revise la punta de inyección. Debería ser posible hacer fluir pequeñas gotas de solución a través de él. De lo contrario, está bloqueado o tiene fugas. Ahora, monte de forma segura el inyector en un sistema de microbomba. A continuación, mueva la posición del inyectrode a las coordenadas objetivo y baje el electrodo al colículo superior, que puede identificarse mediante el registro de potenciales evocados visuales.

Mientras se baja el electrodo, aplique una pequeña presión positiva aplicando una tasa baja de inyección para evitar obstrucciones. Interrumpa la inyección cuando se alcance la estructura. Después de insertar el inyectrode, cubra la corteza expuesta con agar tibio para evitar la desecación.

Después de la colocación final del electrodo, espere 30 minutos para permitir la estabilización del tejido que rodea el electrodo. Luego inyecte de 400 a 800 nanolitros de solución a una velocidad de 40 nanolitros por minuto, hasta la inactivación de la actividad neuronal en el colículo superior. El electrodo debe mostrar una reducción de los picos durante la inyección de la solución inhibitoria.