Entrega de genes subpiales en la médula espinal del ratón para evaluar la expresión génica

Tome un ratón anestesiado, aféitese la espalda y desinfecte la piel.

Haga una incisión en la piel, separe los músculos de las vértebras y retírelos con pinzas.

Perfore las láminas vertebrales para crear grietas, luego retire los fragmentos óseos para exponer la duramadre, la membrana externa de la médula espinal.

Con una aguja, cree una abertura dural y perfore la piamadre subyacente para ingresar al espacio subpial para acceder directamente al tejido espinal.

Tome una aguja de administración que contenga una suspensión de virus adenoasociado recombinante que lleva un gen que expresa proteínas fluorescentes e inyecte la suspensión.

Retire la aguja, sutura los músculos y la piel y deje que el ratón se recupere.

El virus se une a los receptores de las neuronas y las células gliales y se endocita.

Una vez dentro del núcleo, el virus desencadena la expresión génica para producir proteínas fluorescentes.

El modelo de administración de genes subpiales ahora está listo para evaluar la expresión génica diana en la médula espinal.

Comience por anestesiar adecuadamente al animal para la cirugía. Aquí se usa isoflurano. Asegúrese de que no haya una respuesta de pellizco de la pata antes de continuar. Luego cubra los ojos con ungüento oftálmico. A continuación, afeite el lomo del animal con una maquinilla y limpie la piel con clorhexidina al 2%.

Si se van a realizar inyecciones subpiales lumbares, corte la piel que recubre las vértebras T8 a L1 con un bisturí. Y luego use tijeras para separar el músculo paravertebral de las vértebras espinales T10 a T12. Monte al animal en un marco estereotáxico estándar con pinzas espinales para ratones. A continuación, use un taladro dental para afeitar ambos lados de la lámina de las vértebras T10 a T12 hasta que aparezcan grietas.

Luego, use fórceps para eliminar los fragmentos de hueso agrietados y exponer la superficie dorsal de la médula espinal lumbar. La duramadre ahora es visible. Use una aguja de acero inoxidable de calibre 30 para hacer una incisión de 1 a 2 milímetros en la duramadre.

Es importante cortar cuidadosamente la duramadre para evitar lesiones en la membrana pia subyacente.

Ahora, agarre el borde de la duramadre cortada con fórceps y extienda la abertura de la duramadre hasta 5 milímetros. Monte la aguja penetrante pia de calibre 34 y la aguja de inyección de calibre 36 en los brazos Z de dos manipuladores XYZ separados utilizando soportes capilares de vidrio.

A continuación, use una microjeringa de 50 microlitros conectada con un tubo PE-10 o PE-20 para cargar el virus AAV9-UBI-GFP. Después de cargar el virus, conecte el extremo del tubo a la aguja de inyección. A continuación, mientras mira a través de un endoscopio de disección quirúrgica con un aumento de 8 a 10x, use el brazo X para bajar la aguja penetrante de pia en la pia a una profundidad de 1 milímetro. Mantenga el ángulo de la aguja penetrante de 5 a 10 grados, en relación con la superficie del tejido.

Después de abrir la pia, use el brazo X para quitar la aguja penetrante de pia del espacio subpial. Observe el sitio penetrado usando un punto de referencia, como un vaso sanguíneo. Mueva los brazos X, Y y Z del segundo manipulador para colocar la punta de la aguja de inyección cargada con virus AAV9 en el sitio penetrado por pia.

Luego, después de insertar la punta de la aguja de inyección unos 0,5 milímetros en el espacio subpial, use el brazo Z para levantar la pia unos 0,3 milímetros, luego use el brazo X para continuar avanzando la aguja horizontalmente en el espacio subpial. Avance la aguja hasta que entre en el espacio subpial a una profundidad de aproximadamente 2 a 3 milímetros.

Luego, use la microjeringa de 50 microlitros para inyectar el virus AAV9-UBI-GFP en el espacio subpial. Retire la aguja de inyección del espacio subpial después de que se complete la inyección AAV9-UBI-GFP. Cierre el músculo y la piel con sutura de monofilamento fluorado y clips quirúrgicos. Deje que el animal se recupere en una almohadilla térmica antes de alojarlo en una jaula limpia.