Visualización de virus del dengue a través de Alexa Fluor etiquetado
9 de julio de 2011
Aprovechando los avances en el desarrollo de fluoróforo y la tecnología de imágenes, un método sencillo de Alexa Fluor etiquetado de los virus del dengue se ideó para visualizar las primeras interacciones entre el virus y la célula.
El objetivo general de este experimento es etiquetar fluorescentemente el virus del dengue para estudios microscópicos. Prepare los tampones necesarios y purifique el virus del dengue con un cojín de sacarosa; reconstituya el colorante Amy React Alexa Flow y el virus del dengue en tampón de etiquetado. Etiquete el virus del dengue con una concentración de cien micromolar de Alexa Flow.
Incube durante una hora y detenga la reacción de marcado con el reactivo sub. Purifique el virus del dengue marcado mediante una columna de exclusión por tamaño. Retitule el virus marcado mediante ensayo de placas y estime el grado de marcado mediante ensayo de inmunofluorescencia.
Hola, soy Sam Jang de los Laboratorios Nacionales DSO, trabajando en el laboratorio del Dr. Wee en el programa de enfermedades infecciosas emergentes tras la Escuela de Medicina Graduada de la NUS. Hoy les mostraré cómo marcar fluorescentemente el virus Denki con el colorante Alexa Fluor reactivo al amina para estudios de imágenes. Los colorantes Alexa Fluor presentan una estabilidad superior y son menos sensibles al pH que colorantes comunes como la fluoresceína y la rodamina, lo que los convierte en ideales para estudios sobre la incorporación celular y el transporte endosomal del virus.
Un defecto Alexa etiquetado en el virus del dengue facilitará la comprensión de la patogénesis del dengue. Así que comencemos. Antes de la reacción de etiquetado, prepare un tampón de etiquetado fresco y el reactivo de parada según el protocolo escrito, y purifique el virus del dengue mediante un cojín de sacarosa; agregue un volumen apropiado del virus del dengue purificado al tampón de etiquetado en un tubo de microcentrífuga para alcanzar una concentración de 300 millones de unidades formadoras por mililitro.
Esto puede escalarse proporcionalmente. Para la marcación por lotes del virus. Reconstituya el colorante Alexa Fluor liofilizado hasta una concentración de un milimolar en tampón de marcación justo antes de la reacción de marcación.
Minimice la exposición a la luz a partir de este paso. Con fines de demostración, el colorante Alexa floor se dejará sin protección frente a la luz. Añada 800 microlitros del colorante Alexa flow de un milimolar al virus del dengue diluido, agitando suavemente con la punta de la micropipeta.
Incubar durante una hora a temperatura ambiente, protegido de la luz, mezclando mediante inversiones suaves cada 15 minutos. Después de una hora, centrifugar brevemente los tubos. Transferir 800 microlitros de la subregión mientras se agita suavemente con la micropipeta e incubar durante una hora adicional a temperatura ambiente, protegido de la luz, mezclando mediante inversiones suaves cada 15 minutos.
Mientras tanto, equilibre la columna de purificación con 25 mililitros de tampón HNE. Después de la incubación de una hora, aplique el virus marcado a la columna y comience a recolectar el flujo que atraviesa. Llene la columna con tampón HNE.
Una vez que todo el virus marcado haya entrado en la matriz, deseche los primeros 2,5 mililitros del flujo y recoja los siguientes dos mililitros de la fracción de virus marcado. Almacene el virus marcado purificado a menos 80 grados Celsius. Determine el título del virus marcado mediante un ensayo de placas.
En un experimento típico, se debería observar una disminución inferior a diez veces en el título del virus. Después de la marcación, se debe realizar un ensayo de inmunofluorescencia para evaluar el grado de marcación. Para ello, cuente las células virales utilizando un hemocitómetro y añada el volumen adecuado de células al medio de cultivo para alcanzar una densidad de 50 000 células por mililitro.
Coloque un mililitro de células virales por pocillo en una placa de cuatro pocillos que contenga una cubierta de vidrio estéril. Incube las células durante la noche a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono. Retire la placa del incubador y aspire el sobrenadante de cada pocillo; luego, añada las células con aproximadamente un MOI del virus marcado en un volumen de cien microlitros durante 10 minutos a 37 grados Celsius.
Retire el inóculo y lave las células con 0,5 mililitros de tampón PBS por pocillo. Aspire y repita este procedimiento dos veces más. Fije las células con 200 microlitros de paraformaldehído al 3 % por pocillo a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Lave las células tres veces con 0,5 mililitros de tampón PBS por pocillo. Fije las células con la solución de fijación a temperatura ambiente durante 30 minutos. Retire la cubierta del pocillo utilizando pinzas finas.
Drene el exceso de líquido presionando suavemente el borde de la cubreobjetos. Deslícela sobre un papel blanco. Coloque la cubreobjetos con el lado de las células hacia abajo.
Incube 25 microlitros de anticuerpo contra la proteína E del dengue sobre un pedazo de parafina. Incube durante una hora en una cámara húmeda a temperatura ambiente, protegido de la luz. A continuación, transfiera el cubreobjetos a una placa de seis pocillos y agregue dos mililitros de tampón de lavado por pocillo.
Aspire el sobrenadante. Repita estos pasos de lavado otras dos veces tras el último lavado. Retire el cubreobjetos del pocillo utilizando pinzas finas.
Evacúe el exceso de líquido sumergiendo el borde de la cubreobjetos. Deslícelo contra una toalla de papel. Coloque el lado de la cubreobjetos que contiene las células hacia arriba.
Incube 25 microlitros de Alexa en el fondo con el anticuerpo secundario anti-ratón durante ocho ocho sobre un trozo de perfume. Incube durante 45 minutos en una cámara húmeda a temperatura ambiente protegido de la luz. Una vez finalizada la incubación, transfiera el cubreobjetos a una placa de seis pocillos y lave las células tres veces con dos mililitros de tampón de lavado por cada lavado. Tras el último lavado, retire el cubreobjetos del pocillo y enjuáguelo una vez con agua ionizada.
Evacúe el exceso de líquido sumergiendo contra un papel. Coloque cuidadosamente la laminilla sobre la luz del microscopio con ocho microlitros de una solución de montaje suave. Deje que la solución de montaje se asiente durante la noche en aire a cuatro grados Celsius.
La muestra ya está lista para ser visualizada con un microscopio fluorescente o confocal. Coloque una pequeña gota de aceite de inmersión sobre la superficie del cubreobjetos y sujete el microscopio. Deslice la preparación hacia la platina del microscopio.
Ajuste el portaobjetos hasta que el objetivo del microscopio entre en contacto con el aceite de inmersión. Para obtener una imagen clara, apague las luces ambientales utilizando el software Zes Zen. Haga clic en la pestaña del ocular para observar directamente la muestra a través del ocular del microscopio.
Busque un campo con células y ajuste el enfoque. Ahora cambie al modo de adquisición. Para minimizar la interferencia entre canales, seleccione pistas separadas para Alexa Fluor 488 y Finite Four.
Utilice tintes y configure las adquisiciones para la excitación y detección secuencial. Ajuste la ganancia y el desplazamiento de potencia del láser para asegurar que la imagen no esté sobreexpuesta ni subexpuesta. Capture la imagen y analice un área de interés mediante la función de colocalización.
El coeficiente de superposición puede utilizarse para estimar el grado de marcado del virus del dengue mediante el colorante Alexa Fluor. Se realizó un ensayo sencillo de inmunofluorescencia en células virales y el grado de marcado puede estimarse a partir de la colocalización del virus marcado con tinción de anticuerpos anti proteína E. Los valores del coeficiente de superposición oscilan entre 0,65 y 0,8, lo que sugiere que aproximadamente entre el 65 y el 80 % de las partículas virales fueron marcadas con el colorante Alexa Fluor. Para que el procedimiento de marcado sea exitoso, es importante preparar el tampón de marcado inmediatamente antes de comenzar y reconstituir el reactivo Alexa Fluor justo antes del marcado.
La concentración del colorante a utilizar puede optimizarse aún más según sus necesidades. Este método de marcado del virus del dengue puede adaptarse potencialmente para marcar otros virus. Eso es todo.
Gracias por ver este video y buena suerte en su experimento de marcado.
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Resumen
Este estudio presenta un método para la marcación fluorescente del virus del dengue utilizando Alexa Fluor para análisis microscópico. El enfoque permite la visualización de las interacciones iniciales entre el virus y las células huésped.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Virología
- Microscopía de fluorescencia
- Biología celular
Antecedentes
- El virus del dengue es un problema importante de salud global.
- Comprender las interacciones entre el virus y la célula es fundamental para desarrollar estrategias antivirales.
- La marcación fluorescente mejora la visualización de estas interacciones.
- Los avances en las tecnologías de imagen facilitan estudios detallados.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método confiable para marcar el virus del dengue.
- Visualizar las interacciones entre el virus del dengue y las células huésped.
- Mejorar la comprensión de las etapas iniciales de la infección viral.
Métodos Utilizados
- Preparación de los tampones necesarios para la marcación.
- Purificación del virus del dengue utilizando un cojín de sacarosa.
- Reconstitución del colorante Alexa Fluor en tampón de marcación.
- Etiquetado del virus con una concentración específica de colorante.
Resultados principales
- Etiquetado fluorescente exitoso del virus del dengue.
- Visualización de las interacciones virus-célula bajo el microscopio.
- Evaluación de la eficiencia de etiquetado mediante ensayo de inmunofluorescencia.
- Retitulación del virus etiquetado utilizando ensayo de placas.
Conclusiones
- El método proporciona una forma sencilla y eficaz de marcar el virus del dengue.
- La marcación fluorescente facilita el estudio de las interacciones entre el virus y el huésped.
- Esta técnica puede aplicarse a otros estudios virales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La marcación fluorescente directa del virus del dengue con Alexa Fluor permite la visualización precisa de las interacciones entre el virus y la célula, apoyando estudios mecanicistas en etapas tempranas de la investigación de enfermedades infecciosas. Esta capacidad aumenta la confianza predictiva en la validación de dianas e informa estrategias traslacionales para el desarrollo de antivirales y vacunas. La compatibilidad del método con virus vivo y con imágenes cuantitativas refuerza su valor en etapas de descubrimiento y preclínicas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación directa de los mecanismos de entrada y tráfico viral en células huésped.
- Apoya la desactivación de riesgos biológicos al aclarar los eventos iniciales de la infección relacionados con la patogénesis.
- Facilita la validación funcional de objetivos mediante la visualización de las interacciones del virus marcado.
- Mejora la confianza predictiva en las pruebas de hipótesis terapéuticas posteriores.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona un enfoque estandarizado para la preparación de virus marcados con fluorescencia para ensayos basados en imágenes.
- Asegura la reproducibilidad y la evaluación cuantitativa de la eficiencia de marcado mediante inmunofluorescencia y ensayos de placas.
- Permite un marcado por lotes escalable, adecuado para plataformas de cribado de alto contenido.
- Facilita la evaluación confiable de los efectos de compuestos antivirales sobre la entrada y el tráfico del virus en la célula.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con modelos relevantes para la enfermedad al preservar la infectividad viral tras la marcación.
- Permite la continuidad desde el descubrimiento mecanicista hasta la validación preclínica de estrategias de intervención.
- Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante lecturas cuantitativas de imágenes.
- Facilita la alineación de biomarcadores mediante el análisis de colocalización de marcadores virales y celulares.
Integración de la Línea de Procesamiento y Flujo de Trabajo
Este método de marcado se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica, apoyando estudios basados en hipótesis, desarrollo de ensayos y la investigación traslacional sobre la patogénesis viral.
- Biología del Descubrimiento: Mejora la comprensión mecanicista de las interacciones virus-célula huésped mediante la visualización directa y la colocalización cuantitativa.
- Tamizaje: Proporciona preparaciones de virus marcados y reproducibles para el tamizaje basado en imágenes de candidatos antivirales.
- Análisis: Ofrece resultados cuantitativos, como coeficientes de superposición y títulos de infectividad, para análisis comparativos.
- Investigación Traducional: Mantiene el virus funcional para su uso en modelos celulares relevantes para enfermedades y estudios de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Ofrece un protocolo ampliamente adaptable para la marcación de otros virus envueltos en diversos programas de I+D.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en investigaciones virológicas de etapas iniciales.
- Valor operativo: Estandariza los procedimientos de etiquetado y visualización de virus para garantizar reproducibilidad y escalabilidad.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de continuar o descartar proyectos y optimiza la asignación de recursos al permitir una validación robusta de objetivos.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de candidatos a antivirales y vacunas basándose en datos cuantitativos de imagen.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en virología, microscopía de fluorescencia y análisis cuantitativo de imágenes.
- Necesita acceso a plataformas de imagen de alta calidad y software analítico para estudios de colocalización.
- Exige una preparación rigurosa de los tampones y manejo cuidadoso de los colorantes para garantizar la reproducibilidad y minimizar la citotoxicidad.
- Adaptable a otros virus envueltos mediante la optimización del protocolo para sistemas virales específicos.
- Depende del mantenimiento de la viabilidad del virus y de la eficiencia del marcado para aplicaciones posteriores.
