Visualización de virus del dengue a través de Alexa Fluor etiquetado

El objetivo general de este experimento es marcar fluorescentemente el virus del dengue para estudios microscópicos. Prepare los tampones necesarios y purifique el virus del dengue con cojín de sacarosa, reconstituya el tinte de flujo Amy React Alexa y el virus del dengue en el tampón de etiquetado. Etiquete el virus del dengue con cien micromolares de flujo de Alexa.

Troquel durante una hora y detenga la reacción de etiquetado con el subreactivo. Purifique la etiqueta virus del dengue a través de una columna de exclusión de tamaño. Retitule el virus marcado mediante un ensayo de placa y estime el grado de marcaje mediante un ensayo de inmunofluorescencia.

Hola, soy Sam Jang de los Laboratorios Nacionales DSO y trabajo en el laboratorio del Dr. Wee en el programa de enfermedades infecciosas emergentes después de graduarme de la escuela de medicina de la NUS. Hoy les voy a mostrar cómo marcar fluorescentemente el virus Denki con el tinte para la gripe Amy Reactive Alexa para estudios de imágenes. Alexa, mueren por la gripe, tienen una estabilidad superior y son menos sensibles al pH que la dieta común como la fluoresceína y la tarea rumine, lo que los hace ideales para estudios sobre la absorción celular y el transporte endosomal del virus.

El virus del dengue marcado con la falla de Alexa facilitará la comprensión de la patogénesis del dengue. Así que comencemos. Antes de la reacción de etiquetado, prepare un tampón de etiquetado fresco y un reactivo de parada de acuerdo con el protocolo escrito y purifique el virus del dengue con un cojín de sacarosa, agregue el volumen adecuado del virus del dengue purificado al tampón de etiquetado en un tubo de microcentrífuga para lograr una concentración de 300 millones de unidades formadoras por mililitro.

Esto se puede ampliar proporcionalmente. Para el etiquetado de lotes de virus. Reconstituya el tinte de piso Alexa liofilizado a un milimolar en tampón de etiquetado justo antes de la reacción de etiquetado.

Minimice la exposición a la luz a partir de este paso. Para fines de demostración, el tinte para pisos Alexa se dejará sin protección de la luz 800 microlitros de un milimolar. El flujo de Alexa muere al virus del dengue diluido mientras se agita suavemente con la punta de la micropipeta.

Incubar durante una hora a temperatura ambiente protegido de la luz mezclada por inversiones suaves cada 15 minutos después de una hora, centrifugar los tubos brevemente. Un 800 microlitros de la subregión mientras se mira suavemente con la micropipeta incuba durante una hora adicional a temperatura ambiente. Protegido de la luz se realiza mediante suaves inversiones cada 15 minutos.

Mientras tanto, equipara la columna de purificación con 25 mililitros de tampón HNE. Después de la incubación de una hora, aplique el virus etiquetado a la columna y comience a recoger el flujo. Rellene la columna con búfer HNE.

Una vez que todos los virus marcados hayan ingresado a la matriz, deseche los primeros 2,5 mililitros de flujo y recoja los siguientes dos mililitros de la fracción de virus marcada. Ecor y vio el virus etiquetado purificado a menos 80 grados centígrados. Determine el título del virus marcado mediante un ensayo de placa.

En un experimento típico, se debe observar una caída de menos de diez veces en el título del virus. Después del marcaje, se debe realizar un ensayo de inmunofluorescencia para evaluar el grado de marcaje. Para ello, enumere las células virales utilizando un hemocitómetro y el volumen adecuado de células en el medio de crecimiento para lograr una densidad de 50.000 células por mililitro.

Vea un mililitro de células virales por pocillo en una placa de cuatro pocillos que contiene una cubierta de vidrio estéril. Dormir. Incubar las células durante la noche a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Retire la placa de la incubadora y aspire el supinador de pozo, de hecho, las células con aproximadamente un MOI del virus marcado en un volumen de cien microlitros durante 10 minutos a 37 grados centígrados.

Retire el inóculo y lave las células con 0,5 mililitros de tampón PBS por pocillo. Espíritu dis y repita este procedimiento dos veces más. Fije las celdas con 200 microlitros de 3% por pocillo de altura múltiple a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Lave las celdas tres veces con 0,5 mililitros de tampón PBS por pocillo. Alimente las celdas con solución de ización a temperatura ambiente durante 30 minutos. Retire la tapa del pozo con pinzas finas.

Drene el exceso de líquido haciendo DP en el borde de la cubierta. Deslízate contra un papel blanco. Coloque el lado de la celda de la cubierta.

Duerme con 25 microlitros de anticuerpo de proteína e dengue en un trozo de perfume. Incubar durante una hora en una cámara húmeda a temperatura ambiente protegida de la luz. A continuación, transfiera el cubreobjetos a una placa de seis pocillos y agregue dos mililitros de tampón de lavado por aceite.

Aspirar el supinado. Repita estos pasos de lavado dos veces más después del último lavado. Retire el cubreobjetos del pozo con fp fino.

Drene el exceso de líquido sumergiendo el borde de la tapa. Deslízalo contra una toallita de papel. Coloque el lado de la celda de la cubierta.

Duerma en 25 microlitros de piso de Alexa para ocho ocho anticuerpo secundario anti ratón en un trozo de perfume. Incubar durante 45 minutos en una cámara húmeda a temperatura ambiente protegida de la luz una vez finalizada la incubación, transferir la tapa a una placa de seis pocillos y lavar las celdas tres veces con dos mililitros de tampón de lavado Para cada lavado después del último lavado. Retire la tapa del pocillo y enjuague una vez en el agua ionizada.

Escurre el exceso de líquido sumergiéndolo contra un papel. Limpie el deslizamiento de la cubierta en una luz de microscopio con ocho microlitros de solución de montaje suave. Permita que la solución de montaje fije el aire durante la noche a cuatro grados centígrados.

La muestra ya está lista para ser visualizada con un microscopio fluorescente o confocal. Coloque una pequeña gota de aceite de inmersión en la superficie de la cubierta y sujete el microscopio. Deslícese a la etapa del microscopio.

Ajuste la platina hasta que el objetivo del microscopio entre en contacto con el aceite de inmersión. Para obtener una imagen clara, apague las luces ambientales con el software Zes Zen. Haga clic en el grifo ocular para la observación directa de la muestra a través del ocular del microscopio.

Busca un relleno con celdas y ajusta el enfoque. Ahora cambie al modo de adquisición. Para minimizar la diafonía entre las caídas florales, seleccione pistas separadas para Alexa, piso 4, 8, 8 y finito cuatro.

Tintes y adquisiciones de conjuntos para excitación y detección secuenciales. Ajuste la ganancia de potencia del láser y el desplazamiento para asegurarse de que la imagen no esté sobreexpuesta o subexpuesta. Capture la imagen y analice un área de interés mediante la función de colocalización.

El coeficiente de superposición se puede utilizar para estimar el grado de marcaje del virus del dengue por el colorante Alexa Flo. Se realizó un ensayo de inmunofluorescencia simple en células virales y el grado de marcaje se puede estimar a partir de la colocalización del virus marcado. Con un rango de coeficiencia de superposición de tinción anti proteína e y anticuerpo de 0,65 a 0,8, lo que sugiere que aproximadamente el 65 al 80% de las variaciones se marcaron con el tinte para pisos Alexa. Para que el procedimiento de etiquetado tenga éxito, es importante preparar el búfer de etiquetado y comenzar a reconstituir el resumen de piso de Alexa antes del etiquetado.

La concentración de tinte a utilizar se puede optimizar aún más para adaptarse a sus necesidades. Este método de marcaje del virus del dengue en el horizonte puede adaptarse potencialmente para etiquetar otros virus. Así que eso es todo.

Gracias por mirar y buena suerte para su experimento de etiquetado.