La metilación del ADN: Bisulfito de modificación y análisis

El objetivo general de este procedimiento es permitir el análisis de metilación del ADN de los dinucleótidos de CPG mediante la secuenciación genómica del ADN convertido en sulfito. Esto se logra primero desnaturalizando el ADN bicatenario, para que pueda tener lugar la reacción de conversión de bisulfito. El segundo paso es convertir todas las citosinas no metiladas del ADN genómico en uracilo mediante desaminación con bisulfito.

Esta reacción consta de tres fases. La primera es la sulfatación del residuo de citosina mediante la adición de sulfito B al doble enlace cinco seis. En segundo lugar, la desaminación hidráulica de la citosina por derivado de sulfito produce un SSL por derivado de sulfito y, en tercer lugar, la eliminación del grupo sulfonato por tratamiento con álcali da como resultado un residuo de SSL.

A continuación, la región objetivo se amplifica mediante cebadores específicos de conversión de bisulfito y amplificación por PCR. El paso final es la clonación y secuenciación del producto de PCR para proporcionar una resolución de un solo nucleótido para la metilación a través de la molécula de ADN. En última instancia, los resultados muestran la metilación del ADN de los dinucleótidos CPG en el ADN genómico mediante la explotación de la mayor sensibilidad de la citocina frente a la cinco metil citosina a la desaminación de bisulfato en condiciones ácidas.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el análisis de sangre del sur, es que puede permitir la resolución de la metilación de un solo nucleótido. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la epigenética, como el papel de la metilación del ADN en enfermedades humanas como el cáncer. Para preparar muestras de ADN para la conversión de bisulfito, primero incube dos microgramos de ADN genómico con bisulfito, tampón de lisis de ADN y un volumen total de 18 microlitros durante una hora a 37 grados centígrados.

A continuación, desnaturaliza el ADN genómico añadiendo dos microlitros de hidróxido de sodio de tres molares recién preparados hasta una concentración final de 0,3 molares. Incubar las muestras a 37 grados centígrados durante 15 minutos en un baño de agua, seguido de una incubación a 90 grados centígrados durante dos minutos. En un bloque de calor, coloque inmediatamente los tubos en hielo durante cinco minutos, centrifugue los tubos durante 10 segundos a 10, 000 Gs para asegurarse de que el ADN esté en el fondo del tubo, las muestras de ADN desnaturalizado ahora están listas para la desaminación de lucha de células B, que se demostrará a continuación.

Antes de las reacciones de sulfatación y desaminación hidrolítica, prepare soluciones frescas de quinol 10 milimolar y meta de sodio saturado por sulfito pH 5.0. Como el meta de sodio por sulfito es una solución saturada, es posible que queden pequeños grumos sin disolver. Agregue el meta de sodio por sulfito 208 microlitros y quinol 12 microlitros al ADN desnaturalizado 20 microlitros en un volumen final de 240 microlitros.

Agite los tubos y centrifugue durante 10 segundos para asegurarse de que todas las gotas estén en el fondo del tubo. Superponga las muestras con aceite mineral. Incubar las muestras a 55 grados centígrados en un baño de agua durante cuatro a 16 horas, dependiendo de la cantidad y calidad del ADN a convertir.

Es importante que la conversión del bisulfito se realice en la oscuridad para evitar la oxidación. Al final del tiempo de incubación adecuado, haga girar los tubos brevemente en una microcentrífuga para asegurarse de que todo el líquido esté en el fondo del tubo. A continuación, pipetea con cuidado la solución de ADN desde el fondo del tubo sin absorber nada del aceite mineral.

Para los siguientes pasos, nuestro laboratorio utiliza el sistema de limpieza de ADN promega wizard. Agregue un mililitro de resina a las muestras de ADN, invierta el tubo para mezclar, luego pipetee la solución en una jeringa conectada a una columna de desalinización. Por último, para eliminar los iones de bisulfito libres, se pasa el ADN tratado con bisulfito a través de la columna de desalinización y se alude en 50 microlitros de agua Milli Q.

El siguiente paso es eliminar el ático de bisulfito del anillo de uracilo mediante desalinización. Para lograr esto, agregue 5.5 microlitros de hidróxido de sodio de tres molares recién preparados a cada muestra de ADN tratada con bisulfito para una concentración final de 0.3 molar. A continuación, incubar las muestras a 37 grados centígrados durante 15 minutos.

Centrifugar las muestras brevemente y luego agregar un microlitro de ARNt a cada muestra. Neutralice la solución agregando acetato de amonio hasta una concentración final de tres molares. A continuación, el etanol precipita el ADN.

Agregue 330 microlitros de etanol 100% frío y mezcle bien por inversión. Dejar a menos 20 grados centígrados durante una hora para centrifugar durante la noche a 14.000 GS durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, retire todos los restos de sobrenadante y seque al aire el ADN precipitado durante aproximadamente 20 minutos.

Después del secado al aire, es casi imposible ver cómo se resuspende el pellet de ADN en 50 microlitros de 0,1 XTE o se deja con agua a temperatura ambiente durante aproximadamente dos horas durante este tiempo, de vez en cuando, vórtice los tubos para asegurarse de que el ADN se disuelva, seguido de una centrífuga rápida. Una vez que el ADN se disuelve, puede almacenarse a menos 20 grados centígrados durante uno a 10 años, dependiendo de la cantidad y calidad del ADN, o usarse de inmediato. Para la amplificación de PCR, la optimización del cebador es el aspecto más difícil de este procedimiento.

Por lo tanto, se proporcionan las siguientes pautas para ayudar a garantizar el éxito del diseño de la imprimación. Para ilustrar estas directrices, la secuencia diana se ha convertido mediante sulfitos, de modo que cuando se escriben, las citosinas convertidas aparecen como T azules y los sitios CPG no convertidos aparecen como cgs rojos, los cebadores deben tener una longitud de 24 a 30 pares de bases para garantizar la especificidad. Los cebadores deben tener una TM predicha similar por encima de 50 grados Celsius y no diferir en más de uno o dos grados Celsius.

Los cebadores deben contener múltiples bases de aproximadamente 25% C a T para garantizar la especificidad de la conversión. La base final de que los tres extremos primos deben ser de C a T para asegurar la amplificación de los dinucleótidos D-N-A-C-P-G convertidos debe evitarse en la secuencia del cebador para evitar un posible sesgo hacia plantillas metiladas, no metiladas o no convertidas. Sin embargo, si es inevitable, la citosina en el sitio de CPG debe reemplazarse con una Y para ayudar a garantizar una amplificación imparcial del ADN convertido.

Por último, diseñe conjuntos de cebadores anidados o semianidados para garantizar la especificidad o sensibilidad de la reacción de PCR si es necesario. Prepare mezclas de reacción de amplificación de PCR en alícuotas de 25 microlitros para su optimización. Cada reacción contiene por sulfito convertidos en ADN genómico DPS, cebadores de magnesio, cloruro de potasio, clorhidrato de tris, pH 8.3, anac polimerasa para probar el sesgo de amplificación del material metilado o no metilado.

Utilice una muestra de control 50 50 metilada, no metilada, totalmente convertida en bisulfito para probar la amplificación proporcional de PCR con conversión de bisulfito. Los cebadores específicos y la mezcla de reacción de PCR en un termociclador de gradiente de temperatura establecen la reacción de ejecución en un gradiente de más o menos tres grados Celsius desde la TM del cebador a través de ocho a 10 tubos, vórtice los tubos y gira brevemente en una microcentrífuga antes de colocarlos en el termociclador. Esta figura muestra un gel agros con un perfil de amplificación de PCR con gradiente de temperatura a partir de una mezcla de 50% de ADN metilado y no metilado.

Los amplicones y carriles de PCR marcados con los carriles T dos, cinco y ocho se han tratado con una enzima de restricción que digiere solo el ADN metilado. Las condiciones óptimas de amplificación de la PCR deben amplificar los amplicones metilados y no metilados en proporción y sin sesgo, lo que da como resultado una cantidad igual de producto de PCR cortado y sin cortar, como se ve aquí. Las condiciones óptimas de termociclado para la amplificación no sesgada es de 55,6 grados Celsius. La conversión completa del ADN del bisulfito se puede analizar mediante digestión con una enzima específica del sitio de citosina que solo digerirá las líneas de ADN no convertidas tres, seis y nueve.

La conversión completa del ADN de bisulfito se indica aquí por la ausencia de ADN cortado en los tres carriles, carriles tres, seis y nueve. Este gráfico de disociación en tiempo real muestra una proporción igual de mezcla de ADN metilado y no metilado de la línea naranja roja 50 50 en comparación con la amplificación de control de la línea rosa m completamente metilada y la línea verde U de ADN no metilado, que se disocian a 82,9 grados Celsius y 86,9 grados Celsius respectivamente. Esto indica que no hay un sesgo de amplificación basado en la temperatura a la que se disociarán las diferentes moléculas.

Los fragmentos de PCR resultantes de la amplificación de muestras tratadas con bisulfito se pueden visualizar y secuenciar mediante electroforesis en gel agros. Aquí se muestra directamente una traza de secuencia de tres líneas celulares diferentes con sitios CPG resaltados en amarillo, la línea celular X muestra un 100% de metilación en los tres sitios CPG, donde las líneas celulares Y y Z muestran diversos grados de metilación como se ve en las señales GA superpuestas que se muestran aquí. La figura cuatro A es una secuencia de tres líneas celulares diferentes con sitios CPG resaltados en amarillo.

Después de la secuenciación directa de clones individuales, el estado de metilación de las moléculas individuales se puede tabular en un mapa de bisulfito. Para visualizar la metilación de la heterogeneidad, la densidad de metilación en los sitios individuales de CPG se muestra en rojo. En este mapa representativo de bisulfito, análisis de metilación cuantitativa de alto rendimiento de una muestra.

El uso de la tecnología de tipificación epi de secuencianoma puede producir un espectro específico que depende de la presencia de citosinas metiladas, como se muestra en este ejemplo Figura cinco A.Un resumen de las proporciones en la muestra se puede extrapolar en forma de un epigrama figura cinco B.Este ejemplo muestra el porcentaje de metilación del ADN en cada sitio CPG para cuatro líneas celulares diferentes. Finalmente, se puede derivar un resumen del diagrama de metilación figura cinco C del epigrama después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la epigenética exploraran la metilación del ADN y su papel en las enfermedades humanas.