La metilación del ADN: Bisulfito de modificación y análisis

El objetivo general de este procedimiento es permitir el análisis de la metilación del ADN en dinucleótidos CpG mediante la secuenciación genómica de ADN convertido con bisulfito. Esto se logra primero desnaturalizando el ADN de doble cadena, para que pueda tener lugar la reacción de conversión con bisulfito. El segundo paso consiste en convertir todas las citosinas no metiladas del ADN genómico en uracilo mediante desaminación con bisulfito.

Esta reacción comprende tres fases. La primera es la sulfatación del residuo de citosina mediante la adición de bisulfito al doble enlace cinco-seis. En segundo lugar, la desaminación hidrolítica de la citosina por un derivado de bisulfito produce un SSL por el derivado de bisulfito, y en tercer lugar, la eliminación del grupo sulfonato mediante tratamiento alcalino da como resultado un residuo de SSL.

A continuación, la región diana se amplifica mediante cebadores específicos para la conversión con bisulfito y amplificación por PCR. El paso final consiste en la clonación y secuenciación del producto de PCR para obtener una resolución a nivel de nucleótido individual de la metilación a lo largo de la molécula de ADN. En última instancia, los resultados muestran la metilación del ADN en dinucleótidos CpG en ADN genómico mediante la explotación de la mayor sensibilidad de la citosina frente a la 5-metilcitosina a la desaminación con bisulfito en condiciones ácidas.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el análisis de sangre southern es que puede permitir una resolución a nivel de un solo nucleótido de la metilación de d. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la epigenética, como el papel de la metilación del ADN en enfermedades humanas como el cáncer. Para preparar muestras de ADN para la conversión con bisulfito, incube primero dos microgramos de ADN genómico con bisulfito, tampón de lisis de ADN y un volumen total de 18 microlitros durante una hora a 37 grados Celsius.

Luego desnature el ADN genómico añadiendo dos microlitros de hidróxido de sodio tres molar recién preparado hasta una concentración final de 0,3 molar. Incube las muestras a 37 grados Celsius durante 15 minutos en un baño de agua, seguido de una incubación a 90 grados Celsius durante dos minutos. En un bloque térmico, coloque inmediatamente los tubos en hielo durante cinco minutos, centrifugue los tubos durante 10 segundos a 10.000 G para asegurar que el ADN esté en el fondo del tubo; las muestras de ADN desnaturado ya están listas para la desaminación por B cell fight, lo cual se demostrará a continuación.

Antes de las reacciones de sulfatación y desaminación hidrolítica, prepare soluciones frescas de quinol 10 milimolar y sulfito sódico metabisulfito saturado a pH 5,0. Dado que el sulfito sódico metabisulfito es una solución saturada, pueden quedar pequeños grumos sin disolver. Añada 208 microlitros de sulfito sódico metabisulfito y 12 microlitros de quinol al ADN desnaturalizado de 20 microlitros, en un volumen final de 240 microlitros.

Vortexee los tubos y centrifúgelos durante 10 segundos para asegurar que todas las gotas queden en el fondo del tubo. Cubra las muestras con aceite mineral. Incube las muestras a 55 grados Celsius en un baño de agua durante cuatro a 16 horas, dependiendo de la cantidad y calidad del ADN que se va a convertir.

Es importante que la conversión con bisulfito se lleve a cabo en la oscuridad para evitar la oxidación. Al final del tiempo de incubación adecuado, centrifugar brevemente los tubos en una microcentrífuga para asegurar que todo el líquido esté en la parte inferior del tubo. Luego, pipetear cuidadosamente la solución de ADN desde la parte inferior del tubo sin aspirar ningún aceite mineral.

Para los siguientes pasos, nuestro laboratorio utiliza el sistema Promega Wizard de purificación de ADN. Añada un mililitro de resina a las muestras de ADN, invierta el tubo para mezclar y luego aspire la solución con una pipeta y colóquela en una jeringa acoplada a una columna de desalación. Finalmente, para eliminar cualquier ion bisulfito libre, pase el ADN tratado con bisulfito a través de la columna de desalación y eluya con 50 microlitros de agua Milli Q.

El siguiente paso consiste en eliminar el grupo bisulfito del anillo de uracilo mediante desalquilación. Para lograrlo, añada 5,5 microlitros de hidróxido de sodio tres molar recién preparado a cada muestra de ADN tratada con bisulfito, para obtener una concentración final de 0,3 molar. A continuación, incube las muestras a 37 grados Celsius durante 15 minutos.

Centrifugar brevemente las muestras y luego añadir un microlitro de ARNt a cada muestra. Neutralizar la solución añadiendo acetato de amonio hasta una concentración final de tres molar. A continuación, precipitar el ADN con etanol.

Añada 330 microlitros de etanol al 100 % helado y mezcle bien mediante inversión. Incube de una hora a toda la noche a menos 20 grados Celsius y luego centrifugue a 14.000 GS durante 15 minutos a cuatro grados Celsius. A continuación, elimine todos los restos de sobrenadante y seque al aire el ADN precipitado durante aproximadamente 20 minutos.

Después de secar al aire, el precipitado es casi imposible de ver; re suspenda el precipitado de ADN en 50 microlitros de TE 0,1 X o agua, y déjelo a temperatura ambiente durante aproximadamente dos horas. Durante este tiempo, vortexe ocasionalmente los tubos para asegurar que el ADN se disuelva, seguido de una centrifugación rápida. Una vez que el ADN esté disuelto, puede almacenarse a menos 20 grados Celsius durante uno a 10 años, dependiendo de la cantidad y calidad del ADN, o puede usarse inmediatamente. Para la amplificación por PCR, la optimización de los cebadores es el aspecto más difícil de este procedimiento.

Por lo tanto, se proporcionan las siguientes pautas para ayudar a garantizar el éxito en el diseño de cebadores. Para ilustrar estas pautas, la secuencia diana ha sido convertida mediante bisulfito, de modo que, cuando se escribe, las citosinas convertidas aparecen como Ts azules y los sitios CPG no convertidos aparecen como cgs rojos. Los cebadores deben tener una longitud de 24 a 30 pares de bases para asegurar la especificidad. Los cebadores deben tener un TM predicho similar, superior a 50 grados Celsius, y no diferir en más de uno o dos grados Celsius.

Los cebadores deben contener múltiples bases de C a T aproximadamente del 25 % para asegurar la especificidad de la conversión. La base final en el extremo tres prima debe ser una C a T para asegurar la amplificación del ADN convertido. Los dinucleótidos CpG deben evitarse en la secuencia del cebador para evitar sesgos potenciales hacia plantillas metiladas, no metiladas o no convertidas. Sin embargo, si no se puede evitar, la citosina en el sitio CpG debe reemplazarse por una Y para ayudar a garantizar una amplificación imparcial del ADN convertido.

Finalmente, diseñe conjuntos de cebadores anidados o semianidados para garantizar la especificidad o sensibilidad de la reacción de PCR si es necesario. Prepare mezclas de reacción para la amplificación por PCR en alícuotas de 25 microlitros para su optimización. Cada reacción contiene ADN genómico convertido con bisulfito, cebadores DPS, cloruro de magnesio, cloruro de potasio, tris hidrocloruro pH 8,3 y anac polimerasa para evaluar el sesgo de amplificación del material metilado o no metilado.

Utilice una muestra control 50-50 metilada y no metilada completamente convertida con bisulfito para probar la amplificación PCR proporcional con la conversión a bisulfito. Use cebadores específicos y mezcla de reacción PCR en un termociclador con gradiente de temperatura; configure la reacción en un gradiente de más o menos tres grados Celsius desde la temperatura de fusión (TM) del cebador, a lo largo de ocho a diez tubos. Vortexee los tubos y centrifúgelos brevemente en una microcentrífuga antes de colocarlos en el termociclador. Esta figura muestra un gel de agarosa con un perfil de amplificación PCR en gradiente de temperatura a partir de una mezcla de ADN 50 % metilado y no metilado.

Los amplicones de PCR y las bandas marcadas con T, bandas dos, cinco y ocho, han sido tratados con una enzima de restricción que digiere únicamente el ADN metilado; las condiciones óptimas de amplificación por PCR deben amplificar los amplicones metilados y no metilados en proporción y sin sesgo, lo que resulta en una cantidad igual de producto de PCR cortado y no cortado, como se observa aquí. Las condiciones óptimas de termociclado para una amplificación sin sesgo son de 55,6 grados Celsius. La conversión completa del ADN con bisulfito puede analizarse mediante digestión con una enzima específica para sitios de citosina que digiere únicamente el ADN no convertido, bandas tres, seis y nueve.

La conversión completa de ADN con bisulfito se indica aquí por la ausencia de ADN cortado en las tres líneas, líneas tres, seis y nueve. Este gráfico de disociación en tiempo real muestra una proporción igual de ADN metilado y no metilado, línea rojo anaranjada, mezcla 50 50, en comparación con la amplificación control de ADN completamente metilado, línea rosa m, y no metilado, línea verde U, que se disocian a 82,9 grados Celsius y 86,9 grados Celsius, respectivamente. Esto indica que no existe un sesgo de amplificación basado en la temperatura a la cual se disocian las diferentes moléculas.

Los fragmentos de PCR resultantes de la amplificación de muestras tratadas con bisulfito pueden visualizarse mediante electroforesis en gel de agarosa y secuenciarse. Aquí se muestra directamente un cromatograma de secuencia de tres líneas celulares diferentes, con los sitios CPG resaltados en amarillo; la línea celular X muestra una metilación del 100 % en los tres sitios CPG, mientras que las líneas celulares Y y Z muestran grados variables de metilación, evidenciados por señales GA superpuestas que se observan aquí. La figura cuatro A es un cromatograma de secuencia de tres líneas celulares diferentes, con los sitios CPG resaltados en amarillo.

Tras la secuenciación directa de clones individuales, el estado de metilación de las moléculas individuales puede tabularse en un mapa de bisulfito. Para visualizar la metilación heterogénea, la densidad de metilación en sitios CpG individuales se muestra en rojo. En este mapa de bisulfito representativo, análisis cuantitativo de metilación de alto rendimiento de una muestra.

El uso de la tecnología Sequenom Epi Typer puede generar un espectro específico dependiente de la presencia de citosinas metiladas, como se muestra en el ejemplo de la Figura cinco A. A continuación, se puede extrapolar un resumen de las proporciones en la muestra en forma de un epígrafe, figura cinco B. Este ejemplo muestra el porcentaje de metilación del ADN en cada sitio CPG para cuatro líneas celulares diferentes. Finalmente, a partir del epígrafe, tras su desarrollo, puede obtenerse un resumen del gráfico de metilación, figura cinco C. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la epigenética exploraran la metilación del ADN y su papel en las enfermedades humanas.