Visualización de redes neuronales y vasculares en un embrión de pollo

Comience con un huevo de gallina fertilizado con ventana que contenga un embrión en etapa temprana con su tubo neural extirpado al nivel de los somitas uno a siete.

Tome un tubo neural de donante marcado con GFP de un embrión de pollo transgénico compatible con la etapa e impleméntelo en el receptor, asegurando una orientación anatómica adecuada.

Elimine el exceso de líquido alrededor del injerto para mejorar la adhesión entre los tejidos del donante y del huésped.

Selle la ventana con cinta adhesiva transparente para evitar la deshidratación y la contaminación.

Incubar el óvulo hasta que el embrión se desarrolle hasta la etapa deseada.

Retire la cinta.

Identifique una vena vitelina en la yema que transporta sangre hacia el embrión y elimine la membrana vitelina suprayacente.

Con una aguja de vidrio, inyecte constantemente un tinte fluorescente lipofílico en la vena.

Visualice el embrión bajo un microscopio de estereofluorescencia.

El tinte inyectado se une a las células endoteliales que recubren los vasos sanguíneos, resaltando la red vascular, mientras que el tubo neural marcado con GFP permite el seguimiento de la red neuronal.

Cuando esté listo para comenzar el procedimiento de injerto, transfiera con cuidado el tubo neural diseccionado del cristal del reloj al embrión huésped. Coloque el tubo neural en la orientación correcta. Y empuje suavemente el explante adyacente en la región extirpada. Si es necesario, use el microbisturí para recortar el explante al tamaño exacto de la región extirpada.

Una vez en la posición correcta, retire PBS y otro líquido para ayudar a que los tejidos del donante y del huésped se adhieran y establezcan el injerto. La integración exitosa del tubo neural positivo para GFP injertado en el huésped de pollo de tipo salvaje se puede evaluar bajo un microscopio de fluorescencia. Selle toda la ventana con cinta transparente de 24 milímetros de ancho para evitar la deshidratación y la contaminación.

Etiqueta el embrión quimérico. Y devuelva el huevo a la incubadora para un mayor desarrollo.

En el momento experimental deseado, recupere el huevo de la incubadora. Y retire la cinta transparente para acceder al embrión. Una vez visible, ubique una vena accesible en la yema, asegurándose de que el flujo sanguíneo se dirija hacia el embrión.

Elija un punto de ramificación en una de las venas vitelinos para el lugar de la inyección. Use pinzas para quitar la membrana vitelina por encima del punto de inyección elegido rasgando en direcciones opuestas. Luego, ajuste el diámetro de una aguja de vidrio tirada al tamaño de la vena.

Cargue la aguja con 5 a 10 microlitros de solución de DiI. Inserte rápidamente la aguja en la vena. Y sople constantemente con el tubo bucal para permitir que el DiI se una al flujo sanguíneo lentamente sin formar un coágulo. El éxito de la inyección de DiI se puede evaluar observando brevemente el embrión bajo un microscopio de fluorescencia.